土壤微生物量测定方法

1土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按12（v:v）加入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=1molL-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w:v）的浓氧溶液，密闭放置3～4d。待碳酸钠沉降后，取56ml50%氢氧化钠上清液（约19molL-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1L，即为浓度1molL-1NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）=0.5molL-1]：取1742.5g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150rmin-1）上溶解24h即可。（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）=5g100ml-1，pH2.0]：称取50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，用高纯度去离子水定容至1L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）=2g100ml-1]：称取20.0g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7d。（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）=21g100ml-1]：量取37ml分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188ml高纯度去离子水中即可。（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）=1000mgCL-1]）：取2.1254g经105℃烘2～3h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1L。2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix8000）、容量瓶（100ml）、振荡器（300rmin-1）、可调加液器（50ml）、可调移液器（5ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100ml）、聚乙烯提取瓶（100，150ml），聚乙烯塑料桶（20L，带螺旋盖），三角瓶（150ml）、其它常规仪器。3、操作步骤（1）土样前处理新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径2mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1molL-1NaOH溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24h。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。2土壤饱和持水量按Shaw（1958）的方法测定：在圆型漏斗下端装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞玻璃纤维。取50g土壤于漏斗中，夹紧橡皮管，加入50ml水保持30min。然后打开夹子，测定30min内流出的水量。加入的水量减去流出的水量，再加上原来土壤中含有的水量，即为该土壤的饱和持水量，以烘干土壤质量百分数表示。（2）熏蒸称取经前处理后相当于20.0g烘干基重的新鲜土壤(25.0g)3份于50ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓硫酸处理洗涤后烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），干燥器底部加入少量水以保持湿度。用土壤熏蒸抽真空装置抽真空，在–0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5min。关闭真空干燥器阀门，移置25℃黑暗条件下熏蒸24h。将熏蒸过的土壤转移到另一个干净的真空干燥器中，反复抽真空（–0.07MPa）6次，每次3min，彻底除去土壤中的氯仿，直到无氯仿味为止。否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。（3）提取将熏蒸土壤无损地转移到125ml聚乙烯提取瓶中，加入80ml0.5molL-1K2SO4，土水比为1:4（w:v），振荡（25℃，300rmin-1）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于125ml塑料瓶中。在熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于125ml聚乙烯提取瓶中，加入80ml0.5molL-1K2SO4同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白。浸提液应立即分析，或在–18℃下保存。要注意的是低温（–18℃）下保存的土壤浸提液解冻后会出现一些白色沉淀，据推测为CaSO4和K2SO4，对浸提液中有机碳测定没有影响，可不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985），但解冻后也应立即测定，且在取样前应将浸提液彻底混匀。（4）测定取10ml土壤提取液于40ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10ml六偏磷酸钠溶液（pH2.0），使提取液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。采用Phoenix8000碳–自动分析仪测定样液中的有机碳含量。先采用2mm细管向样液中通入高纯度氮气5～10min，先除去溶解在样液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步排除残留的CO2。再进入紫外氧化室，在过硫酸钾溶液和磷酸溶液作用下样液中的有机碳全部氧化为CO2，产生的CO2经纯化后再通过红外检测器测定。详细操作步骤参见仪器使用说明。标准碳工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mgCL-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，用高纯度去离子水定容。即得到0、20、40、60、80、100mgCL-1系列标准碳溶液。分别吸取上述不同浓度度的标准碳溶液10ml于40ml样品瓶中，按上述相同方法测定。（5）结果计算：土壤微生物量碳：BC=EC/kEC式中：EC=熏蒸土壤提取的有机碳–不熏蒸土壤提取的有机碳kEC为转换系数，取值0.45。3二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取-流动注射氮分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：同上（2）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）=0.5molL-1]：同上（3）硫酸铬钾还原剂：称取50.0g分析纯硫酸铬钾[KGrSO42]，溶于200ml分析纯浓硫酸，用蒸馏水稀释到1L。（4）硫酸铜溶液[c（CuSO4）=0.19molL-1]：称取30.324g分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水并定容至1L。（5）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=10molL-1]：称取400g分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1L。（6）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=4molL-1]：称取160g分析纯氢氧化钠溶于双蒸水并定容至1L，使用前用真空抽滤瓶（膜孔径0.45µm）过滤。（7）氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.01molL-1]：取2.5ml4molL-1NaOH用去离子水稀释至1L。（8）硼酸溶液（ρ（H3BO4）=2g100ml-1）：称取20.0g分析纯硼酸（H3BO4）溶于蒸馏水定容至1L。（9）硫酸溶液[c（H2SO4）=0.05molL-1]：取28.8ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ=1.84gml-1）用蒸馏水稀释到1L，此溶液H2SO4浓度为0.5molL-1，将该溶液稀释10倍即可得到0.05molL-1硫酸溶液。再用0.1molL-1标准硼砂溶液标定其准确浓度。（10）标准硼砂溶液[c（Na2B4O710H2O）=0.1molL-1]：先将分析纯硼砂（Na2B4O710H2O）在55℃蒸馏水中重结晶，过滤后得到的结晶放入装有食糖和氯化钠饱和溶液烧杯的干燥器中（相对湿度70%）干燥。准确称取经重结晶和干燥的硼砂38.13672g，溶解于蒸馏水并定容至1L。（11）指示剂贮存液：称取1.0g氨混合指示剂溶解于10ml0.01molL-1NaOH和10ml95%乙醇混合液中，用去离子水定容至200ml。该贮存液可存放1个月。（12）指示剂溶液：取10ml指示剂贮存液用去离子水稀释并定容至500ml，用真空抽滤瓶（膜孔径0.45µm）过滤。注意：此溶液应使用前一天配制，最多可使用1周。（13）标准氯化铵贮存液[ρ（NH4Cl）=1000µgNml-1]：称取经105℃烘2～3小时的分析纯氯化铵3.8190g溶于去离子水中并定容至1L。此贮存液可稳定保存数月。（14）标准氯化铵溶液[ρ（NH4Cl）=50µgNml-1]：取10ml1000µgNml-1氯化铵用去离子水稀释至200ml。此溶液最多保存7d。2、仪器设备流动注射氮分析仪（FIAStar5000，丹麦福斯公司）、真空抽滤瓶（膜孔径0.45µm）、容量瓶（100ml）、其他仪器设备同上。3、操作步骤（1）土壤前处理、熏蒸、提取同上。（2）提取液中硝态氮还原：吸取15.0ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5molL-1K2SO4浸提液于250ml消化管中，加入10ml硫酸铬钾还原剂和300mg锌粉，至少放置2h后再消化。研究结果表明熏蒸与不熏蒸土壤提取液中硝态氮含量差异很小，在测定土壤MB-N时，可以不包括硝态氮，即省略提取液中硝态氮还原过程。4（3）消化：方法Ⅰ：吸取10.0ml熏蒸与不熏蒸土壤0.5molL-1K2SO4浸提液（或经还原反应后的浸提液）于250ml消化管中，加入0.2ml0.19molL-1CuSO4溶液、5ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物（如经浓硫酸处理并洗涤后烘干的瓷片，0.5cm大小），混合液消化变清后再回流3h。（4）消化液中氮测定：消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100ml容量瓶中，至体积大约为70ml，待再冷却后慢慢加入10ml10molL-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀（以免因局部碱浓度过高而引起消化液中NH4+的损失），再用去离子水定容至100ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar5000型）测定。采用40µl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂Ⅰ为4molL-1NaOH溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。校正曲线溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml50µgNml-1标准氯化铵溶液于100ml容量瓶中，分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样品，用去离子水定容至100ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5µgNml-1系列标准氯化铵溶液，采用测定KTN方法模块测定和制备工作曲线，校正曲线溶液最少应每个月制备一次。其他具体操作参见仪器使用说明。（5）计算：土壤MB-N=EN/kEN式中：EN=熏蒸土壤提取的全氮–不熏蒸土壤提取的全氮；kEN为转换系数，取值0.45。三、土壤微生物生物量磷（氯仿熏蒸-NaHCO3提取–Pi测定–外加Pi校正法）1.试剂（1）磷酸二氢钾溶液[ρ（KH2PO4）=250µgPml-1]：称取1.0984g经105℃烘2～3h的分析纯KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至1L。（2）碳酸氢钠浸提液[c（NaHCO3）=0.5molL-1，pH8.5]：称取42.0g分析纯碳酸氢钠溶于800ml蒸馏水，用1molL-1NaOH调节溶液pH至8.5，再蒸馏水定容至1L。该浸提液不能放置过久，否则因释放CO2使溶液pH值升高。（3）硫酸溶液[c（H2SO4）=2.5molL-1]：量取70.0ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ=1.84gml-1），用蒸馏水稀释定容至500ml即可。（4）钼酸铵溶液[ρNH46Mo