环状RNA的定量PCR检测实验方法

环状RNA的定量PCR检测实验方法1.介绍环状RNA（circRNA）已经在许多物种中被鉴定出来，包括人类，老鼠，线虫和腔棘鱼。人们认为，部分环状RNA通过调节microRNA（miRNA）而起到调控基因表达的作用。环状RNA调节基因表达的机制之一是通过作为miRNA的“海绵”，隔离miRNA并降低其可用性以降低靶mRNA的稳定性或翻译。根据其他研究的分子功能，circRNA也可以作为RNA结合蛋白（RBP）的海绵，提供组装RBP的平台，并且与mRNAs相联结以在转录后调节其表达。我们使用TRIzol从这些细胞中分离总RNA，通过RNaseR处理提高circRNA的浓度，逆转录（RT）后通过实时定量（q）PCR分析鉴定circRNA。使用从RT-qPCR获得的数据来计算细胞之间的circRNA表达的变化情况。2.材料注意：所有的试剂，材料和仪器应小心处理，使它们保持无核酸酶污染。2.1RNA分离1.增殖细胞（P）和通过癌基因诱导衰老（OIS）的衰老细胞（S）。2.Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）3.涡流混合器。4.细胞刮刀。5.TRIzol®试剂（储存在4°C）。6.无核酸酶的水。7.不含RNase的1.5mL微量离心管。8.NanoDrop分光光度计。2.2通过RNaseR提高circRNA浓度通过RNaseR处理以降解线性RNA，提高RNA样品中的circRNA纯度。1.从增殖细胞和衰老细胞分离的总RNA（参见RNA分离）。2.无RNA酶的1.5mL微量离心管。3.20U/μLRNaseR.4.RNaseR10×反应缓冲液[0.2MTris-HCl（pH8.0），1MKCl和1mMMgCl2]（包括酶）。5.40U/μLRiboLock核糖核酸酶抑制剂。6.Eppendorf®Thermomixer®R.7.5:1酸性苯酚-氯仿。8.3M乙酸钠溶液，pH5.2。9.15mg/mLGlycoBlueTM共沉淀剂。10.NanoDrop分光光度计。2.3通过逆转录合成cDNA用提取的总RNA或者RNaseR处理的RNA合成cDNA，两者类似。对于第一链cDNA合成，引物用随机引物。由于circRNA缺少poly（A）尾巴，所以不推荐用oligo（dT）作引物合成cDNA。1.RNaseR处理或未处理过的总RNA。2.无核酸酶的水。3.150ng/μL随机引物组。4.10mMdNTPmix。5.20-40U/μLRNA酶抑制剂（例如RNasin核糖核酸酶抑制剂）。6.最大值逆转录酶。7.5×RT缓冲液（250mMTris-HCl（25℃，pH8.3），375mMKCl，15mMMgCl2，50mMDTT）（与Maxima一起提供逆转录酶）。2.4实时定量PCR：扩增和验证序列使用SYBRGreen进行circRNA的PCR扩增。扩增曲线，溶解曲线和qPCR产物琼脂糖凝胶电泳，成功证明了给定circRNA的扩增。如下所述。1.2.3的cDNA。2.无核酸酶的水。3.管家基因的正向引物和反向引物。选择一种或几种不会随着衰老而改变的RNA，如18SrRNA和GAPDHmRNA，使用引物3在线工具（）或NCBI引物-BLAST（）。4.针对感兴趣的circRNA的统一跨越式引物。可以使用我们的免费在线网络工具进行设计CircInteractome（）。5.使用KAPASYBR®FASTqPCR试剂盒或SYBRGreen其他厂商。6.MicroAmp®光学96孔反应板。7.MicroAmp®光学胶膜。8.QIAquick凝胶提取试剂盒（50）。9.MPS1000迷你盘旋转器。10.实时定量PCR仪。3.方法3.1RNA分离1.用DPBS洗涤细胞两次（也可以使用PBS）。2.紧接着，将1mLTRIzol加入到细胞板中，在室温下摇动孵育10分钟，并收集到无RNA酶的1.5mL微量离心管中。3.加入0.2mL（1/5体积的TRizol）氯仿并涡旋混合最高速度10秒。4.在4℃下以15,000×g离心10分钟。5.小心地将200μL上清液转移到新的1.5mL不含RNase的微量离心管中，不干扰中间层。6.立即加入200μL的2-异丙醇（与水相等体积）并颠倒5-10次混匀，在室温孵育10分钟或在冰上孵育30分钟。7.在4℃以15,000×g离心10分钟，然后完全除去上清液。8.加入1mL冰冷的70％乙醇（70mL乙醇混合30mL无核酸酶水），涡旋振荡，然后在室温下以15,000×g离心10min。9.完全去除上清液，并在室温下空气干燥RNA沉淀2-3分钟。10.加入50μL不含核酸酶的水溶解沉淀，涡旋振荡后置于冰上。这种RNA可以直接使用或储存在-20或-80°C以备后用。11.可以使用NanoDrop分光光度计确定从每个样品中分离的RNA浓度和总RNA量。在260/280的吸光度和1.8-2.00比率范围内显示的RNA质量良好。3.2利用RNaseR进行CircRNA浓缩（可选）1.将5μg总RNA与2μLRNaseR10×反应缓冲液，1μLRNaseR和1μLRiboLock混合，并使用无RNase的水调整最终的体积到20μL。37°C孵育15分钟。2.加入180μL无RNase的水并混合。加200μL的酸性苯酚-氯仿（5：1），涡旋10秒并在室温下15,000×g离心5分钟。3．收集上清液150μL。加入15μL乙酸钠（3M，pH5.2），1μLGlycoBlue和375μL（收集上清液体积的2.5倍）100％乙醇，颠倒5-10次，混匀。4.在-20°C孵育1小时，15,000×g离心10分钟，4°C沉淀RNA。5.小心取出上清液，不要搅动沉淀。加入1毫升的70％乙醇，涡旋震荡管子数秒。在室温下15000×g离心10分钟，完全去除上清液，室温下空气干燥RNA沉淀2-3分钟。6.加入20μL无核酸酶的水，涡旋至溶解，然后迅速将溶解的RNA置于冰上或储存备用。RNA浓度可以使用NanoDrop分光光度计测定。3.3通过反转录合成cDNA1.每个RNA样品用于两个反应：逆转录（RT）和不逆转。2.“逆转”组使用1μgRNA，1μL随机六聚体，4μL5×RT缓冲液，1μLRiboLock，1μLdNTPmix，1μLMaximaRT，最终体积用无RNase水定容至20μL。对于“无RT”组，除去MaximaRT：1μgRNA，1μL随机六聚体，4μL5×RT缓冲液，1μLRiboLock，1μLdNTPmix和不含RNase的水定容，最终体积20μL。3.混合并旋转几秒钟，使反应混合物沉淀管的底部。4.室温（25°C）孵育10分钟，然后使用Thermomixer在50℃温育30分钟。5.通过85℃加热5分钟来灭活RT酶。6.加入480μL无核酸酶的水将反应体系扩至500μL。7.cDNA可以在-20°C或-80°C储存，或立即进行qPCR扩增。3.4RT-PCR：序列扩增和验证3.4.1准备qPCR引物1.使用无RNase的水溶解引物（见图2）到终浓度为100μM。2.用无核酸酶的水制备正向引物和反向引物的浓度为1μM的引物溶液，例如，从100μM每种引物储液中加入10μL的980μL的无核酸酶水混合均匀。3.4.2定量PCR（qPCR）:(见注4）1.用光学胶膜包被孔，涡旋混匀。2.使用MPS1000MiniPlateSpinner旋转96孔板30秒，以沉降反应孔底部的反应物。3.按照以下步骤设置ABI7500qPCR：95°C5分钟，95°C15秒，60°C60秒40个循环。建议最好在测试新引物时加入解离曲线分析。3.4.3PCR产物的验证1.PCR扩增曲线应包含一个线性部分（见图3a）。解离曲线中的单峰表示来自扩增反应的一个PCR产物（见图3b）。为了验证PCR产物，可用含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳。“无RT”体系不应该显示任何PCR产物，而RT体系应该显示一个单一的与预期PCR扩增子大小匹配的DNA产物（见图3c）。通过使用QIAquick凝胶提取试剂盒，按照说明书从琼脂糖凝胶中纯化预期的PCR产物。通过测序验证PCR产物，可以使用正向或反向引物进行PCR测序，这可显示circRNA的连接序列（参见图3d）。一旦circRNAPCR扩增得到验证，可以进行数据分析，以发现衰老期间与特定增殖细胞相比较的特定circRNA的变化3.4.4数据分析如图3a所示，阈值位于指数放大阶段的线性部分。循环阈值（Ct）是荧光信号越过阈值所需的周期数。Ct值用于计算增殖细胞和衰老细胞之间的circRNA表达差异。将从增殖细胞获得的每个引物组的Ct值与从衰老细胞扩增cDNA时观察到的值比较。看家基因转录组的Ct值之间的差异被用来标准化每个circRNA的Ct值。衰老细胞中与增殖细胞相比，任何circRNA表达的倍数变化用公式2△CT（Ct衰老-Ct衰老）计算。4注意1.所有的试剂，材料和仪器都应该被处理，使其避免核酸酶污染。冰上解冻试剂。孵育前，轻敲管子混匀反应组分，快速离心（10000×g，5秒）以将内容物沉淀至管的底部。2.这个RNA含有高浓度的circRNA，可以直接用于cDNA合成。3.单位定义：在标准分析条件下，1URNaseR可以在37℃下10分钟内将1μgpoly（A）+线性RNA降解为酸溶性核苷酸。4.对于96孔板中的一个反应，加入10μLSYBRGreen，5μLcDNA和5μL引物混合物。可为“无RT”体系制备相同的混合物。对于大量的反应，可以预准备主混合物。5.实例：对于circRNA-X，增殖细胞的Ct是27.8，而衰老细胞的Ct是17.8。circRNA的倍数变化是X=2（27.8-17.8）=210=1024.因此，circRNA-X被上调与增殖细胞相比，衰老细胞为1024倍细胞。