蛋白质的相互作用研究方法

两个或两个以上的蛋白质结合在一起执行生物学功能时，发生相互作用。使蛋白质到发挥作用的位点。使蛋白质的构象发生改变，激活或抑制。蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。第三节蛋白质的相互作用的研究方法免疫共沉淀Co-immunoprecipitation(Co-IP)GSTpull-downassay荧光共振能量转移FluorescentResonantEnergyTransfer（FRET）双分子荧光互补（BimolecularFluorescentComplement）BIFC酵母双杂交系统YeastTwo-HybridSysterm其它方法1.原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用一、免疫共沉淀2.方法1)收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3)12000rpm离心30min4）收集上清并加入适量抗体，4ºC摇动1h～过夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液，4ºC摇动1h6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液7）离心弃上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）离心，上清液跑SDS-PAGE胶10）考马氏亮兰染色、银染WesternBlot质谱分析3.注意事项1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3)对照实验的设计。二、GST融合蛋白进行Pulldow实验1原理细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。两种应用：1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用2方法：1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4ºC2h3）离心弃上清4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，离心5）取上清进行SDS-PAGE电泳，6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行GST-PulldownAssay三、Fluorescenceresonanceenergytransfer1.荧光信号的产生荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。什么是FRET?当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。3.绿色荧光蛋白60年代，Shimomura等首先从水母（AequoriaVictoria）中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。OsamuShimomuraOsamuShimomurainthelabinthebasementofhishome.Heisholdingasampleof“real”GFPisolatedfromAequoreavictorea,notproducedbybacteria.InordertodohisresearchShimomuraestimatesthathecollectedoveramillionAequoreaspecimens。（OneAequoreaweighabout50g）WilliamWard(right)metDouglasPrasheronajellyfish-huntingexpeditioninthe1980sDouglasPrasherwasthefirstpersontorealizethepotentialofGFPasatracermolecule.GFPcouldbeusedtoreportwhenaproteinwasbeingmadeinacell.GFPcouldpotentiallybeaveryusefulreportermolecule.容易检测分子量小不需要其它底物DouglasPrasher1992克隆了GFP基因Chalfie将GFP基因转入大肠杆菌中。SergeyA.Lukyanov在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。他还发现了红色荧光蛋白。RogerTsien对GFP的机理作出了贡献。制造了很多GFP突变体。2008年诺贝尔化学奖GFP主要应用:•对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达,如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程。膜蛋白的移动（FluorescenceRecoveryAfterPhotobleachingFRAP）•蛋白之间的相互作用（FRET）•报告分子将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检测基因表达的时间和部位。人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移Lookatphysicalinteractionsbetweenproteins四、BimolecularFluorescentComplementation五、YeastTwo－HybridSysterm1.原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含Transcription-activatingdomain的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。1）两种蛋白之间是否有相互作用2）寻找一种蛋白可能的相互作用蛋白2.应用（1）它并非对所有蛋白质适用。融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛查结果.3.双杂交系统的缺陷（2）假阳性的发生较为繁多。在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型：Ⅰ型：表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录。Ⅱ型：表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录。Ⅲ型：表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。3.双杂交系统的缺陷（3）在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖。（4）还应意识到的一点是，虽然双杂交系统可筛选出大量蛋白质相互作用，但其中部分蛋白质可能处于不同的细胞类型、细胞空间或生长发育的不同时期，生理状态下是不可能发生相互作用的。•蛋白质与小分子化合物的相互作用是进行药物设计的基础。基于结构的药物设计在药物的研发中已取得较大的成功，近年来通过化合物数据库与蛋白质结构的分子对接进行虚拟筛选大幅度地提高了先导化合物发现的成功率。写出两种检测蛋白质之间的是否有相互作用的方法？请写出主要操作步骤。