总RNA提取及QPCR标准操作流程

v1.0可编辑可修改1总RNA提取及反转录标准操作流程一、仪器试剂Trizol试剂三氯甲烷（4℃预冷）异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷）DEPC处理水/RNasefreewater（反转录试剂盒）无酶EP管200μL无酶PCR管冷冻离心机NanoDrop2000反转录试剂盒（TakaraRR036A）二、实验须知1.选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。2.操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。3.尽可能在冰盘上操作。3.取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管后，袋子及时封好。4.Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。v1.0可编辑可修改2三、样品处理1.组织样品将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。2.贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量Trizol溶液，吹打混匀，并吸至无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。培养皿Trizol体积皿（6孔板）1mL6cm皿3mL10cm皿10mL注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。3.悬浮细胞500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mLTrizol溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。4.注意事项v1.0可编辑可修改31）样品裂解液可室温存放数小时，-80℃可至少存放一月。2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加一步离心操作，具体步骤如下：○112000g、4℃离心10min，胞外基质、多糖、高分子量DNA将会形成颗粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。○2移除脂肪层，将澄清的上清液移至新的无酶EP管中。四、总RNA提取1.每1mLTrizol溶液加入200μL三氯甲烷，立即盖上盖子，剧烈振荡15s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min。2.4℃下，12000g离心15min，液体分为三层，RNA位于上层水相，约占总体积的50%，移至新无酶EP管中（用20-200μL的枪吸取上清，吸上清时，EP管倾斜大约45度，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）。3.加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次，不应用振荡器混匀），室温静置10min。4℃下，12,000g离心10min，可见羽毛状白色RNA沉淀，小心吸出上清。4.1mL75%乙醇洗涤两次（4℃7500g离心5min，加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不可使用振荡器震荡或枪头吸打沉淀）。注：RNA可与75%乙醇中4℃保存一周，-80℃保存一年。5.室温干燥室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。视沉淀量加入适量DEPC水（至少15μL）溶解沉淀，使用NanoDrop测定RNA浓度。6.首次提取RNA时须跑胶验证RNA质量，核酸胶配置为：1%琼脂糖/1×TAE缓冲液，取5μLRNA溶液混上μLLoadingBuffer，上样跑胶，电泳大概15min，凝胶成像仪上观察RNA条带质量，RNA条带一般为三条，理想的RNA条带为：明亮的28S条带与18S条带，并且28Sv1.0可编辑可修改4条带亮度大约为18S条带两倍，微弱或没有5S条带。五、反转录用PrimeScriptTM反转录试剂盒（TakaraRR036A）将总RNA反转录成cDNA。1.于200μL无酶PCR管中按反应体系配置RT液。反应体系如下：试剂使用量终浓度5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μL1×总RNA500ngDEPC处理水补足至10μL2.轻柔混匀后进行反转录应，条件如下：37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶失活反应）4℃3.得到的RT反应液使用NanoDrop测定cDNA浓度，-20℃保存。v1.0可编辑可修改5QPCR标准操作流程一、QPCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行绝对定量分析或通过内参对比进行相对定量分析的方法。本实验室常采用相对定量进行分析。1.SYBRGreen：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性结合DNA双链，发出荧光信号，而游离SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2.Ct值Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。1）荧光阈值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle3-15。2）Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：Ct=-1/lg(1+e)×lgX0+lgN/lg(1+e)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，e为扩增效率，常默认为1，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。v1.0可编辑可修改6二、仪器试剂SYBRGreenPCRMasterMix引物ddH2OcDNA模板EP管96孔板迷你离心机7200RPM（TOMOSTMC15287）离心机（湘仪L530）QPCR仪（伯乐Q200）三、QPCR操作步骤1.QPCR每孔体系如下：根据样品数量计算所需体系预混液体积（预混液中不包含cDNA模板），并按组分比例配置，试剂使用量cDNA模板10pg-100ngSYBRGreenPCRMasterMix10μL上游引物1μL下游引物1μLddH2O补足至20μLv1.0可编辑可修改7振荡器振荡或用枪吹打均匀，迷你离心机快速离心去除气泡。cDNA模板根据使用量用ddH2O稀释到合适的浓度。2.根据实验设计，小心地将体系与cDNA模板加入每孔之内。例如：两组样品：对照组、处理组，每组样品三个样，检测目的基因表达量，绿色部分表示检测内参基因表达量，蓝色部分表示检测目的基因表达量，96孔板设置如下：123456789101112A对照组1对照组1对照组1对照组1对照组1对照组1B对照组2对照组2对照组2对照组2对照组2对照组2C对照组3对照组3对照组3对照组3对照组3对照组3D处理组1处理组1处理组1处理组1处理组1处理组1E处理组2处理组2处理组2处理组2处理组2处理组2F处理组3处理组3处理组3处理组3处理组3处理组3GH1)样品全都稀释至50ng/μL，模板量采用100ng，即每孔须加样2μL。2)预混液1：内参基因18个孔，我们配置20个孔体系，即200μLSYBRGreenPCRMasterMix，20μL内参基因上游引物，20μL内参基因下游引物，ddH2O120μL。预混液2：目的基因18个孔，我们配置20个孔体系，即200μLSYBRGreenPCRMasterMix，20μL目的基因上游引物，20μL目的基因下游引物，ddH2O120μL。注：配置预混液时须适当多配，EP管及枪头易附着预混液引起损失，例如18个孔可配置20-22孔的预混液。v1.0可编辑可修改83)根据96孔板设置，分别将预混液加入孔内，同一预混液不需换枪头，注意不要将枪打到第二档，避免产生气泡。4)根据96孔板设置，分别将样品加入孔内，每一孔都必须换枪头，避免交叉污染。封上封口膜，用硬卡片左右上下来回刮几下，使封口膜与96孔板贴紧，避免交叉污染，离心机1500g×2min离心。3.上QPCR仪进行反应分析，反应程序如下Step195℃30secStep295℃5secStep360℃30sec设置Step2-339个循环Step4添加溶解曲线注：该反应程序仅是一般性建议，如有需要请根据具体情况优化。4.数据导出，进行定量分析。相对定量分析举例如下：第一步计算△Ct=基因Ct值-内参Ct值第二步计算△△Ct=处理组△Ct-对照组△Ct第三步计算2-△△Ct内参(Ct)基因（Ct）△Ct△△Ct2-△△Ct对照组处理组1处理组2v1.0可编辑可修改9最后结果对照是1，处理小于1，说明该基因表达下调。注：相对定量计算繁琐复杂，初学者需在师兄师姐指导下进行处理数据，熟练后方可独自处理数据。四、注意事项1.Mix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后存放在4℃下。2.配制稍过量体系，减少加样误差，最好能在冰上操作。3.加样时，每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一枪头加样。4.所有成分加完后，离心去除气泡。5.每个样品至少3个平行孔。6.QPCR仪昂贵脆弱，首次使用须在师兄师姐指导下使用。