分子病理学常用研究技术原理及应用

分子病理学常用研究方法原理及选择实验方法在科研工作中的意义决定本项研究的意义与水平：①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究②高水平假说+一般手段→高水平的研究③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究④低水平假说+一般手段→低水平的研究FromProf.XWBian工欲善其事必先利其器立题的先进性手段的先进性科研水平先进性选择实验方法的基本原则必要性可行性为什么要选择这个方法替代方法经费实验室条件时间基于硬件条件，选择最具有说服力的方法1．为没有工作经验的医学研究生编写一本适合自学的手册式教材，为他们做课题时更快、更好地选择合适的实验技术提供决策参考。2．重点介绍同类实验技术的发展沿革、优劣比较；不同实验技术的特点、用途、相互关系、发展趋势；各类实验技术的关键、操作要点和选择示范。3．重点强调医学实验技术的原理与选择，而非具体操作，亦非理论知识。常用医学实验动物模型的种类及选择组织学实验技术细胞生物学实验技术分子生物学实验技术蛋白质化学技术免疫学实验技术医学微生物学实验技术医学实验技术原理及选择分子病理学常用实验方法•组织标本取材与固定•病理制片•切片•染色：常规/特殊•原位蛋白质检测•原位核酸检测组织取材固定不固定冻存（不提倡）冻存包埋冰冻切片HE染色特殊染色IHCISH电镜蛋白质、核酸提取固定不固定分子生物学实验-20℃保存IF/IHC/ISH组织标本一般处理流程细胞标本一般处理流程活细胞细胞爬片细胞离心涂片细胞培养离心后包埋制片冻存细胞悬液固定形态学IHCISHProtein/DNA/RNA分子生物学IF、FCM印片法穿刺法沉淀法细胞爬片法适用范围活检组织标本、手术切除标本的细胞取材实质器官的病变区细胞取材体液多细胞少的标本有贴壁生长特性的细胞，如纤维母细胞、粘液癌细胞优点简便省时，细胞抗原保存较好操作简便，细胞形态保持较好操作简便，细胞形态保持较好操作简便，保持细胞形态及活性缺点细胞分布不均匀，易重叠，影响标记效果细胞分布不均匀细胞分布不均匀，易重叠，影响标记效果适用细胞种类较少细胞取材方法适用范围及优缺点比较组织固定定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内物质尽量接近其生理状态时的形态结构和位置的过程意义：防止自溶防止腐败最大限度保存细胞和组织的抗原性保留特殊成分：糖原、核酸、色素等组织固定的方法蒸汽固定法浸入法灌注法微波固定法某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质手术取材组织标本和细胞涂片仅适用于动物实验常用固定剂醛类固定剂非醛类固定剂丙酮及醇类固定剂双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原对组织穿透力强，收缩性小是最常用固定剂10%中性福尔马林液4%多聚甲醛缓冲液适用于多肽类激素的组织固定常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应穿透性很强，保存抗原活性较好常用于冰冻切片及细胞涂片固定2.5%戊二醛（电镜）组织病理制片技术常规组织病理制片脱水，透明，浸蜡，包埋，切片组织病理制片技术组织芯片近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物TissueMicroarray组织病理制片技术显微切割：microdissection选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中常常遇到却又不易解决的问题该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术细微：微米、纳米级切割原位：所取材料定位清楚同质：所取材料在一定层次上相同结合：与其他实验技术结合显微切割技术的特点显微切割本身不能对样品进行研究，必须同其他实验技术结合，其切割目标完全取决于研究目的显微切割的方式手动直接显微切割机械辅助显微切割液压控制显微切割激光捕获显微切割（lasercapturemicrodessection,LCM）全自动组织处理机石蜡包埋机石蜡切片机震荡切片机硬组织切片机冰冻切片机冰冻切片机常用组织切片染色方法未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率苏木精－伊红染色（HE）HE染色能非常鲜明地对组织和细胞染色，是最基本、使用最广泛的技术方法，又被称为常规染色。DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色特殊染色显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能突出显示感染的霉菌区别常规HE染色不能鉴别的病变，如V.G染色可区分胶原纤维和平滑肌显示某些常规HE染色中不能看到的目的物，如网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等结缔组织染色胶原纤维染色VanGieson氏苦味酸—酸性品红染色法（简称V.G法）Masson氏三色染色法Mallory氏三色染色法Pollak氏三色染色法SiriusRed苦味酸法等分布最广、含量最多的一种纤维来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢性肾小球肾炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风湿性肉芽肿时Aschoff’s巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、慢性阑尾炎、肝硬化。血管壁的胶原纤维染色对病理诊断有重要意义。如良性高血压的小动脉玻璃样变（V.G阳性）；恶性高血压小动脉管型纤维素样坏死（V.G阴性而纤维素染色阳性）；高血压性肾固缩，其小动脉V.G阳性呈红色，而淀粉样物质沉积的小动脉壁V.G染色呈黄色胶原纤维染色的应用在病理诊断上主要用于和肌纤维相鉴别结缔组织染色网状纤维染色是网状结缔组织内的一种纤维，纤细而有分支，直径约0.2~1mm，无弹性，穿行于细胞体之间，共同构成网状支架。HE染色不易辩识，用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故称嗜银纤维主要分布在淋巴组织、骨髓、扁桃体、胸腺、基底膜、血管（特别是毛细血管）、脾窦、肝窦、肌纤维周围、神经纤维、脂肪细胞周围及肺泡等结缔组织染色网状纤维染色Perdrau氏法、Foot氏法、氢氧化银液法、Wilder氏氢氧化银液法、James氏法、Naoumemko-Feigin氏法、DelRio-Hortega氏法、Hortega氏法、Bielschowsky氏法、Hamason-Lushbangh氏法、醋酸氨银染色法（汪荣法）和组织块镀银法等常用于区别癌和肉瘤：癌巢周围常有网状纤维包裹；用于基底膜染色，鉴别原位癌或原位癌早期浸润。鉴别血管内皮瘤和外皮瘤：血管内皮瘤瘤细胞呈泡巢状，周围被网状纤维包绕；血管外皮瘤瘤细胞间可见较多网状纤维。区别脑肿瘤：脑原发性肉瘤周围有较多网状纤维、脑血管周围肉瘤组织内有较多网状纤维，其它脑肿瘤少见网状纤维网状纤维染色的应用结缔组织染色弹力纤维染色弹力纤维（Elasticfiber）广泛分布于身体各处，以肺泡壁、动脉壁和皮肤最为丰富。直径约0.2~1mm，纤维分支，交织成网，电镜下无周期性横带。对沸水、弱酸和碱有一定抵抗力，但可被胃液、胰液等消化间苯二酚品红法、醛品红法、地衣红法、Verhoeff氏法、Hart氏法、酸性地衣红姬姆萨法、醛复红阿辛蓝法、碱性蓝B染色法、弹力、胶原纤维的双重组合染色法和显示胶原、网状和弹力纤维的三联法弹力纤维增生：原发性或继发性高血压的小动脉、皮肤弹力纤维瘤、老年弹力纤维增生症、心内膜弹力纤维增生症、乳腺癌的弹力纤维增生等。弹力纤维断裂、崩解：老年性肺气肿、主动脉粥样硬化、梅毒性主动脉炎、皮肤环状肉芽肿等。弹力纤维染色的应用肌肉组织染色A.V.G法、Mallory三色染色法、Gomori多色染色法、Gomori氏改良多色染色法、铁苏木素法、偶氮桃红染色法、横纹肌的组织块染色法、苏木素碱性品红苦味酸法、酸性复红光绿染色法、酸性复红染色法、CV-AF染色法和变色酸2R亮绿染色法等未分化间叶性肿瘤，如横纹肌肉瘤的来源确定炎症渗出纤维素、弥散性血管内凝血的纤维素染色神经胶质瘤研究脂类染色中性脂肪（甘油三酯）染色苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、苏丹黑及油红O胆固醇及胆固醇酯染色硫酸铁铵法、高氯酸萘醌法、醋酸铜脂肪酸染色法、酸性苏木因染色法等动脉粥样硬化病灶、肿瘤组织坏死灶、细胞内类脂沉积、脂性肾病的肾小管、肾上腺皮质中胆固醇类激素含量增减的测定磷脂染色由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的碱基组成，是细胞膜和细胞内膜性结构的主要组成成分，在大脑、神经组织、骨髓和肝脏等含量较多常用显示方法有酸性苏木素法和吡啶提取法神经组织主要由磷脂和糖脂构成，用此法可以显示磷脂，用PAS显示糖脂糖原染色糖原又名肝糖，以大小不等的颗粒贮存于肝细胞及肌细胞浆中，遇碘变褐色，易溶于水机体坏死后，糖原即被破坏，须取新鲜标本并及时固定碘酸-Schiff氏法（PAS）能打开多糖类结构的乙二醇基（-CHOH-CHOH-）或氨羟基（-CHOH-CHNH2-）的碳键，生成醛基化合物，暴露出游离醛基（-CHO）。再与无色品红液作用，生成新的红色或紫红色复合物，即Schiff反应。糖原被染成红色，细胞核呈蓝色该方法对含乙二醇基或氨羟基的多糖呈阳性反应急性心肌缺血时心肌糖原消失，饥饿时肝糖原减少，糖尿病时肝、肾、肾曲小管可出现大量糖原色素染色含铁血黄素染色鉴别组织或细胞中的黄棕色色素性质黑色素染色含黑色素的组织切片在HE染色中容易与含铁血黄素、脂褐素等混淆脂褐素染色在老年性萎缩和恶液质患者的实质细胞、病毒性肝炎时星形细胞内有脂褐素出现胆色素染色化学成分是胆红素和橙色血质，为不含铁的血红蛋白分解产物钙盐染色病理性钙化是常见病理变化神经组织染色尼氏体染缓冲亚甲蓝法（Pischingert法）、混合染色法（焦油紫、硫堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝法）、Thionine氏硫堇法、甲苯胺蓝法、焦油紫法、培花青法等尼氏体的存在或消失是神经细胞是否受损的重要指标。脑缺血、脑炎、脊髓前角灰质炎及轴突反应等病变时，神经元受损，尼氏体可溶解消失神经轴突染色轴突有嗜银性，常用银浸镀法、甘氨酸银浸镀法和Holmes氏法染色周围神经干病变可用此法了解神经纤维破坏程度及范围，如麻风病、维生素B1缺乏症或一些中毒性周围神经疾病等神经髓鞘染色髓鞘（myelin）是包裹在神经轴突外面的节段性管状鞘，是由雪旺氏细胞的胞膜（周围神经纤维）或少突胶质细胞的胞膜（中枢神经纤维）包卷轴突作螺旋状盘绕。髓鞘由鞘磷脂构成，含60%的类脂质和40%的蛋白质碳酸锂苏木素法、砂罗铬花青法、四氧化锇法、Weil氏铁明矾苏木素法、Weigert铁苏木素法、Kultsohitsky酸性苏木素锇酸法、Luxol氏坚牢蓝甲苯酚紫法和Marchi氏锇酸法等。神经胶质细胞染色氯化金升汞法、PTAH法、Holzer氏磷钼酸结晶紫法、Scharenberg氏法、Rio-Hortega氏法等，均属镀金法，在加入二氯化汞的氯化金溶液中，星形胶质细胞具有嗜金性。神经胶质细胞瘤与脑膜瘤、室管膜瘤等鉴别时往往需要做胶质细胞染色核酸及核蛋白染色体染色Feulgen氏染色显示DNA的一种常用方法。基本原理是在酸水解下，去除DNA中的嘌呤，暴露出脱氧核糖核酸的醛基，后者再与Schiff氏试剂反应，生成紫红色产物，用显微分光光度计和流式细胞测量计对细胞分别进行静态DNA测量和流式细胞测量核仁组成区（NORS）蛋白染色是rRNA的染色体片段，与嗜银酸性非组蛋白有关。rRNA基因直接控制着核糖体和蛋白质的合成。计数细胞内NORS的数量可反映细胞增殖的情况。经典方法是银染法，如PLOTON改良法，镜下NORS位于细胞核内呈黑色的颗粒状病理内源性沉着物染色纤维素染色甲基紫、MSB和PAS等染色法。炎症渗出性改变、DIC、高血压的小血管壁及一些胶原性疾病的疏松纤维淀粉样物质染色刚果红