高效液相色谱法培训课件

高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。第一节概述HPLC液-固吸附液-液分配正相色谱反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析空间排斥色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱假相色谱胶束色谱环糊精色谱亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳键合相色谱正相色谱（normalphase）流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:氨基柱、氰基柱、硅胶柱。常用流动相为极性小的有机溶剂。反相色谱（reversedphase）流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有：ODS(C18)，C8，C2。常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。离子抑制色谱（ionsuppressionchromatography）——调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。离子对色谱（ionpairchromatography）——将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。常用反离子有：季铵盐——用于酸类烷基磺酸盐——用于碱类离子色谱法（ionchromatography）离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。空间排斥色谱（stericexclusion）也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。凝胶渗透——以有机溶剂为流动相凝胶过滤——以水溶液为流动相对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。胶束色谱(micellarchromatography)表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudophasechromatography）。手性色谱(chiralchromatography)用于分离手性药物对映体的一种有效技术，可分为直接法和间接法两类：直接法手性固定相法（chiralstationaryphase;CSP)手性流动相法(chiralmobilephaseadditive;CMPA)间接法—手性试剂衍生化法chiralderivatizationreagent,CDR)第二节高效液相色谱仪色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置高效液相色谱仪组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统溶剂色谱泵自动进样器HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统液相色谱流程图启动液相色谱仪器的流程开启HPLC系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机启动色谱管理软件准备流动相过滤，脱气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵液相柱---保留值与pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6*250mm,5um流动相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.5&2.6温度：50℃流速：1.0mL/min.2.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分按极性分：极性、弱极性、非极性按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱对溶剂的要求水：去离子水自动纯水仪纯净水商品瓶装水溶剂:色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）试剂:分析纯•不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。•理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动过滤与脱气流动相的保存有机溶剂流动相：室温下密封，避光保存缓冲盐流动相：当日现配现用：低温下密封保存，一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器流动相的保存有机溶剂流动相：室温下密封，避光保存缓冲盐流动相：当日现配现用：低温下密封保存，一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器1．梯度洗脱的特点（1）改善分离,加快分析速度；（2）改善峰形,减少拖尾,有利于痕量组分的检测；（3）增加峰容量；（4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上,保持柱性能长期良好；（5）下次分析时,流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有差异,可能会引起基线漂移2．梯度洗脱的主要条件①A流动相/弱溶剂组成；②B流动相/强溶剂组成；③梯度时间；④梯度曲线：线性、凸型或凹型等。强溶剂A%time125梯度：低压混合低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当，梯度的准确性受影响滞后体积（系统体积）设计合理梯度滞后：系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度阻尼器混合器梯度滞后大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml滞后体积变化的影响设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果：梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积，改善了梯度性能普通的低压梯度系统输液泵多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相源源不断地输送到色谱柱中。柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵压最高为400kg/cm2。这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物，含强络合剂的溶液等。过滤——用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气——采用超声或过滤的方法注意流动相使用前冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！进样阀1柱泵324定量圈进样孔6废液5废液Inject6柱泵3214定量圈进样孔废液5废液Load注意：使用后应清洗！进样注意点进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。进样方法整个定量圈体积进样——为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相（见下图）。SampleMobilephase例20l定量圈，进样体积不能超过10l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。部分定量圈体积进样——当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：不得超过定量圈体积的1/2量检测器紫外检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射示差检测器质谱色谱图minH光谱图nmAA-λ曲线(定性)A-t曲线(定量)蒸发光散射检测器是通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。原理：组分先引入已通气体（N2,空气）的蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射光强度而获得组分的浓度信号。本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度洗脱基线稳定。组分的气溶胶喷雾蒸发检测N2光源溶剂泵色谱柱流出物注意：流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐，若调节pH可用氨水、醋酸。质谱检测器43%22%8%7%5%4%10%1%UV-VISDADFluRefraElecConducotherMs检测器使用统计HPLC检测器应提供的功能对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应•对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=2~4定量限（LOQ）：S/N=8~10好的信噪比有利于：•更好的色谱峰确认•更好的定量•更好地完成色谱峰纯度/均一性6:1NS吸光度（AbsorbanceUV/Vis）检测目前实验室中最流行的选择•多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA）测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大吸光度检测器（UV/Vis）－优点这种检测器简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm吸光度检测器（UV/Vis）－缺点由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：•用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长•缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响背景吸收对紫外检测器噪音的影响UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA溶剂混合的基线噪音色谱条件色谱柱：C18