提高缺氧耐受力功能评价方法(征求意见稿)及修订说明资料

-1-附件5：提高缺氧耐受力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1试验项目1.1体重1.2常压耐缺氧实验：存活时间1.3常压缺氧模型实验：红细胞数和血红蛋白，丙二醛（MDA），总抗氧化能力（T-AOC）1.4亚硝酸钠中毒缺氧实验：1.4.1缺氧损伤实验:高铁血红蛋白含量（MetHb）1.4.2缺氧存活实验:存活时间2试验原则所列指标均为必做项目3结果判定3.1常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒缺氧实验、常压缺氧模型实验三项实验中任两项结果阳性可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能。3.2其中缺氧存活实验、缺氧损伤实验的结果均为阳性可判定亚硝酸钠中毒缺氧实验结果阳性。-2-提高缺氧耐受力功能检验方法MethodfortheAssessmentofEnhancingAnoxiaEnduranceFunction1.常压耐缺氧实验1.1原理缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。1.2材料250mL磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰（或等量氢氧化钠和碳酸钙）。1.3实验动物推荐用近交系成年小鼠，单一性别，小鼠体重18－22克，每组10-15只。1.4实验方法1.4.1剂量和分组至少设三个剂量组，同时设对照组。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。1.4.2受试样品的给予经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。1.4.3实验步骤每日经口灌胃给予受试样品，对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，按体重调整给予受试样品的量。各组于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250mL磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡的时间。1.4.4检测指标小鼠因缺氧而死亡的时间。1.5数据处理-3-数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。1.6结果判定受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。1.7注意事项：1.7.1每个磨口瓶内只放1只小鼠。1.7.2磨口瓶一定要密闭封严，以防漏气，否则会影响实验结果。1.7.3磨口瓶必须等容量(误差1ml)，实验前先用水加以校正。1.7.4每批实验动物的体重应尽量保持一致。2常压缺氧损伤模型实验2.1原理在总大气压保持不变的情况下，降低空气中氧的百分含量，机体吸入氧量降低，导致血液中氧含量降低，组织细胞不能从血液中获得充足的氧而使能量代谢障碍，导致重要脏器组织细胞的损伤。2.2仪器低氧分压呼吸效应实验系统、血细胞分析仪、可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器。2.3实验动物推荐用近交系成年小鼠，单一性别，体重18－22g，每组10-15只。2.4实验方法2.4.1剂量和分组至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组二个对照组。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推-4-荐量的30倍。2.4.2受试样品的给予经口灌胃给予受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。2.4.3实验步骤2.4.3.1造模方法每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予同等容量溶剂。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。每次给予样品后，将模型对照组与各剂量组的实验动物依次放入常压缺氧装置中，通过充入氮气方法把装置内的氧含量从21%大气氧含量调整下降至10.0±0.5%氧含量，维持此低氧含量处理样品组和模型对照组动物6～8h/天，每周5～6次，连续2～3周。末次缺氧处理后，采血并取脑进行各项指标的检测。2.4.4指标检测体重、血红蛋白含量（Hb）、脑匀浆丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）。2.4.4.1血红蛋白含量测定方法EDTA·K2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，全血抗凝后用一般血常规检验的血细胞分析仪检测(仪器法)。2.4.4.1.1试剂配制乙二胺四乙酸二钾（EDTA·K2·2H2O，MW404.47）,称量8mgEDTA·K2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50μl抗凝剂可抗凝1ml小鼠全血。1.5～2.2mg的EDTA·K2可阻止1ml血液凝固。2.4.4.1.2采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。2.4.4.1.3检测分析上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪检测血液红Hb。上机操作参照仪器说明书。2.4.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定-5-2.4.4.2.1原理MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。2.4.4.2.2试剂0.2M乙酸盐缓冲液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸钠溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸钠SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸盐缓冲液pH7.40.2M磷酸氢二钠1920mL0.2M磷酸二氢钾480mL2.4.4.2.3实验步骤2.4.4.2.3.1样品制备组织匀浆样品：取一定量的大脑组织，生理盐水冲洗、拭干、称重，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。2.4.4.2.3.2样品测定试剂空白管样品管标准管10％脑组织匀浆0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸盐缓冲液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行2.4.4.2.3.3计算B-AB-A1过氧化脂质含量＝————×C×K=———×40×————————（nmol/mg组织）F-AF-A0.2×10%×1000A:空白管吸光度B：样品管吸光度-6-F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）K：稀释倍数2.4.4.3组织中总抗氧化能力（T-AOC）测定方法2.4.4.3.1原理机体中有许多抗氧化物质，能使Fe2+还原成Fe3+，后者可与菲啉类物质形成稳定的橙黄色络合物，通过在520nm比色可测出其抗氧化能力的高低。2.4.4.3.2试剂采用商品试剂盒：抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒。2.4.4.3.3样品制备准确称取脑组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），2000～2500r/min离心10min，取上清液待测。同时用双缩脲试剂测定10%脑组织匀浆蛋白。2.4.4.3.4样品测定：按试剂盒的操作要求进行。如：试剂对照管（mL）样品管（mL）10％脑组织匀浆ａ*试剂一1.01.0试剂二2.0mL2.0mL试剂三应用液0.5mL0.5mL漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟试剂四0.2mL0.2mL待测样本ａ*试剂五0.2mL0.2mL混匀，放置10分钟，蒸馏水调零1cm光径，520nm测各管吸光度。*参考取样量：10%组织匀浆参考取样量：0.1～0.2ml2.4.4.3.5计算ODU-ODC总抗氧化能力＝——————÷30×N÷Cprot（单位/mg蛋白）0.01ODU:测定管吸光度ODC：对照管吸光度N：反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量）Cprot：稀释倍数待测样本蛋白浓度（mg/ml）-7-2.5数据处理数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F值，F值F0.05，各组均数间差异无显著性；F值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。2.6结果判定模型对照组与阴性对照组比较，Hb、MDA升高、T-AOC含量降低有统计学显著性意义（P0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组MDA含量降低或T-AOC含量升高有统计学意义（P0.05），且Hb＜210g/L，判定该项实验结果阳性。注:红细胞增多症评价标准参考值Hb＞210g/L。3亚硝酸钠中毒缺氧实验3.1原理亚硝酸钠使二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，生成高铁血红蛋白（MetHb），破坏血红蛋白携氧能力，造成组织细胞缺氧，随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb含量增加，导致组织缺氧直至死亡。3.2实验动物推荐使用近交系成年雄性小鼠，体重18～22g，每组10～15只。3.3材料亚硝酸钠,20μl毛细管,1ml注射器，秒表。3.4剂量分组实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组。受试样品给予时间30天。3.5缺氧损伤实验3.5.1实验步骤各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶-8-剂，连续30天,于末次给样后1小时，各组按80～100mg/kgBW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10gBW），1h、2h各采血一次，测全血高铁血红蛋白(MetHb)含量。3.5.2全血高铁血红蛋白(MetHb)含量测定方法(参照GB8788—1988高铁血红蛋白定量测定法)3.5.2.1原理高铁血红蛋白在波长630nm处有一特有的吸收光带，当加入氰化物后，高铁血红蛋白即转化为氰化血红蛋白，此吸收光带亦随即消失。因此加入氰化物前后用分光光度计（或光电比色计）测定其吸光度之差，按标准计算高铁血红蛋白的含量。3.5.2.2试剂1/15M磷酸氢二钠溶液：准确称取Na2HPO4·12H2O23.87g，用蒸馏水溶解稀释至1L。1/15M磷酸二氢钾溶液：准确称取KH2PO49.07g，用蒸馏水溶解稀释至1L。1/60MpH6.6磷酸盐缓冲液：量取1/15M磷酸氢二钠溶液3.75ml，1/15M磷酸二氢钾溶液6.25ml，蒸馏水30m1，混合后即可使用（此液用时配制）。5％（W/V）氰化钾（钠）溶液。5％（W/V）高铁氰化钾溶液。1％tritonX－100（辛烷基酚聚氧乙烯醚）溶液。3.5.2.3操作步骤取2支小试管，以“A”、“B”编号，各加1/60MpH6.6磷酸盐缓冲液4.5ml，被检查末梢血40μl，0.5ml1％tritonX－100。“A”管于630nm波长，以磷酸盐缓冲液或蒸馏水调零测得吸光度为D1后，加入5％氰化钾（钠）溶液50μl，混匀，放置2min，以同样波长测得吸光度为D2。“B”管加入5％高铁氰化钾溶液50μl，在2～5min后，在630nm波长处测得吸光度为D3，然后加入5％氰化钾（钠