G2M检验点调控机制研究概述

G2/M检验点调控机制研究概述季宇彬1,2,3，高鹏1,2,，邹翔1,2,3（1．哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076；2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076；3．哈尔滨商业大学药物所博士后科研工作站，哈尔滨150076）摘要：G2/M检验点是阻止带有DNA损伤的细胞进入有丝分裂期的最后一道关卡，是目前研究的热点，Cdc2(Cdk1)-cyclinB复合物是G2/M检验点调节的关键因子，Cdc2(Cdk1)-cyclinB的活性受多种因素的调控，现对G2/M检验点调控机制的研究现状作一综述。关键词：G2/M检验点；cyclinB；Cdc2；Cdc25Abstract：G2／McellcyclecheckpointsisthefinalhurdletopreventacellwithDNAdamagefromgoingintomitosis，andiscurrentlyonahot.TheComplexofCdc2(Cdk1)-cyclinBisthekeyfactoroftheG2/Mcellcyclecheckpoints.TheactivityofCdc2(Cdk1)-cyclinBisregulatedbymanyfactors.ThisoverviewwouldexplainthestatusquoofmodulatingmechanismofG2/Mcellcyclecheckpoints.Keywords：G2／Mcellcyclecheckpoints；cyclinB；Cdc2；Cdc25细胞周期指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程，通常分为Gl期、S期、G2期和M期，在这四个时相中均发生特定的生物化学反应。正常细胞中，在G1/S和G2/M期的转换以及S期的进行都是受到严密调控的。为保证细胞的遗传物质正确复制并被精确传到下一代，长期的进化过程使细胞发展并拥有一套严格有效的周期检查点(cellcyclecheckpoints)机制[1]。检查点又称检验点、检测点或关卡(checkpoint)。DNA损伤关卡(DNAdamagecheckpoints)是指DNA损伤引发的能使细胞周期延迟或阻滞的生化调控途径。DNA损伤关卡并不是DNA损伤所激活的特有调控途径，而是在正常生长情况下所具有的生化反应途径，只不过在发生DNA损伤后这种作用被放大。多种因素可以引起DNA损伤而最终导致基因产生错义突变、缺失或错误重组；DNA损伤会引发多种细胞反应，包括DNA修复、细胞周期延迟或阻滞、细胞凋亡等。其中细胞周期延迟或阻滞是通过DNA损伤检验点完成的。DNA损伤检验点主要包括G1/S检验点、S检验点和G2/M检验点。G2/M期DNA损伤检验点的作用是阻止带有DNA损伤的细胞进入有丝分裂期的最后一道关卡；根据损伤的形式不同，分别激活ATM-Chk2-Cdc25和ATR-Chk1-Cdc25两条通路[2]，抑制Cdc2(Cdk1)-CyclinB的活性，阻止细胞进入M期。Cdc2(Cdk1)-cyclinB复合物是G2/M检验点调节的关键因子，很多相关基因蛋白则通过直接或间接影响cyclinB1-Cdc2活性或定位参与G2/M检验点调控作用。检验点机制的异常会导致周期调控的异常进而可导致细胞的持续性增殖，使肿瘤发生。1Cdc2(Cdk1)/cyclinB1DNA发生损伤后，ATM/ATR-Chkl/Chk2-Cdc25A/B/C通路的成员相继被激活或者失活，最终，由Cdk-cyclin复合物感受信号，决定细胞周期的进程。在哺乳动物细胞中，存在着不同的细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk以及不同的细胞周期蛋白cyclin，对不同的细胞周期阶段进行调控，细胞周期的不同阶段起作用的Cdk-cyclin复合物亦不同[3]。cyclinB1-Cdc2复合物又称有丝分裂促进因子(MPF)，是G2/M期检验点的关键调节因子，当细胞在G2期遭受DNA损伤时，G2/M期DNA损伤检验点就会抑制cyclinB1-Cdc2复合物的活性而防止进入有丝分裂，阻滞细胞周期进展，从而使细胞有充足的时间修复损伤的DNA，以维持基因组的完整性。1.1Cdc2的表达与G2/M检验点Cdc2的表达异常，会使细胞周期进程发生紊乱，不能正常生长、分化。Cdc2过表达往往导致细胞细胞周期进程发生紊乱，恶性增殖，形成肿瘤。Yasui等[4]用Westernblot研究了胃癌、结肠癌中Cdc2的表达量，结果表明：Cdc2的表达量较正常细胞高，有显著性差异。在肝癌方面，Li等[5]报道Cdc2在70%的肝癌组织中过表达。有研究表明：Cdc2基因在人类神经胶质瘤中发挥重要作用，向下调节Cdc2基因的表达可抑制细胞增殖，引起G2/M阻滞[6]。由此笔者认为，Cdc2过表达可能使细胞越过G2/M检验点。1.2cyclinB1的表达与G2/M检验点在一些类型的肿瘤细胞系如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、宫颈癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病的细胞系中都检测到了cyclinB1的过表达，过表达的cyclinB1大多定位在细胞质，而且其mRNA水平也较高，但mRNA水平的差别并不象蛋白水平差别那么明显，表明cyclinB1的失调更大程度上是发生在转录后水平[7]。cyclinB1在癌细胞中过表达，可能与激酶Cdc2形成复合物，启动有丝分裂，越过细胞周期检查点，导致失控性的细胞增殖有关。cyclinB1启动子直接受c-myc和p53调节，但它们的作用相反。p53能通过直接抑制cyclinB1的转录和核定位，调节G2期检查点。而cyclinB1的过表达和相关的Cdc2激酶的活化，可越过p53介导的G2/M阻滞[8-9]。。如果c-myc过表达、p53丢失则会上调cyclinB1的表达，进而引起纺锤体检查点的改变[10]。Santana等[11]报道：癌基因H-Ras能以p53非依赖性的方式调控G2/M期检查点。H-Ras能诱导SW480细胞和Hela细胞中cyclinB1启动子活性，增加cyclinB1的mRNA和蛋白表达水平，提高cyclinB1-Cdc2复合物表达水平和酶活性。另有报道：AuroraA和h-CPEB过表达时会协同刺激cyclinB1和CDK1mRNA尾的多腺苷酸化，进而引起cyclinB1和C的过表达，这有助于越过G2或纺锤体检查点，造成染色体异常，导致遗传不稳定性的积累，促使肿瘤发生[12-13]。1.3Cdc2-cyclinB1的活性与G2/M检验点Cdc2的激活依赖于分裂期cyclinB1的积累，cyclinB1合成起于S期，在向G2-M期过渡中逐渐增加并达高峰，它与Cdc2结合成MPF复合物(pre-MPF1)。但由于M期的早期，Cdc2的Tyr15和Thr14位点被Weel和Myt1激酶磷酸化，所以CyclinB-Cdc2(Cdk1)复合物呈失活状态，其活化需要Cdc25磷酸酶家族将这些位点去磷酸化[14]，同时需要Cdk激酶(CDKactivatingkinase，CAK)使Cdc2的Thr161磷酸化。当Wee1的活性下降和Cdc25使Cdc2去磷酸化，Cdc2活化的障碍C去除，激活的Cdc2还可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一个反馈环。由此看出，一旦G2期细胞发生DNA损伤或者DNA复制受阻，G2/M检验点可以通过减少cyclinB1来降低Cdc2活性或使Cdk1-cyclinB1复合物及时失活，使周期运行暂时停滞在G2/M期，这样细胞才能有时间对受损的DNA或者复制错误进行修复和校正，避免有丝分裂灾难。然而，在一些人类细胞中，当细胞周期接近M期时，CyclinB1的水平并未增加，研究发现，在这些细胞中，CyclinA/Cdk2复合物是活化Cdc2的关键调控因素，这条信号传导通路在肿瘤细胞中通常是失控的[14]。Cdc2的活性还受Cdk的抑制蛋白(cyclin-dependentkinaseinhi-bitors，CKI)的负向调节。CKI是近年来发现的参与细胞周期调控的抑制物，是一种具有抑制Cdk功能的新蛋白质，能在细胞周期的特定时刻负向调控Cdk活性而控制细胞周期的进程。哺乳动物细胞里有2类CKI，一类是Cip/Kip家族，包括p21，p27和p57；另一类是Ink4家族，包括p15，p16，p18和p19。在正常细胞中，p21和PCNA可与多种不同的cyclin/Cdk复合物结合成四聚体，其中包括cyclinB1与Cdc2形成的复合物，并对其活性具有抑制作用。p53可被Cdc2-cyclinB磷酸化，刺激其对DNA的结合，诱导p21基因的转录进而抑制Cdc2的活性[15]。研究发现：p53和p21cip1/WAF1突变的细胞株将过早离开G2/M期周期阻滞，进入有丝分裂或启动DNA复制。这将引起基因组的不稳定，最终导致癌突变的积聚。有人认为：APC/C介导的p21降解会完全地促成Cdk1的激活[16]，这也可以证明在G2/M检查点p21具有重要作用。p18[17]基因编码的蛋白质属于细胞周期抑制性调控因子，它与cdc2的关系尚不明了，但有研究表明p18在G2/M期受Cdc2激酶的磷酸化[18]。1.4Cdc2-cyclinB1的定位与G2/M检验点cyclinB1含有两个控制胞质-核穿梭的结构域：核定位信号(nuclearlocalizationsigna，lNLS)和胞质滞留信号(cytoplasmicretentionsigna，lCRS)。NLS通过使cyclinB1与核运输因子importin-β相互作用而将cyclinB1-Cdc2复合物缓慢运往细胞核。CRS内含有核输出信号(nuclearexportsigna，lNES)，NES介导着核输出因子CRM1依赖的核输出，以确保有丝分裂前cyclinB1-Cdc2复合物的细胞质定位。有丝分裂的进入除了需要cyclinB1-Cdc2复合物的完全活化外，还需要前期末cyclinB1-Cdc2复合物的快速入核。这种快速的核输入，需要cyclinB1含NES的CRS磷酸化。活化的cyclinB1-Cdc2复合物转位入核后，使核内蛋白磷酸化，调节着染色质的浓缩、核膜降解、纺锤体的组装等，推动M期进展，在中后期转变中cyclinB1通过泛素化途径降解，使Cdc2失活。DNA损伤后，p53的表达量和活性增加，引起p21和14-3-3σ表达上调，14-3-3σ与周期素B1的结合增强，抑制cyclinB1入核，调节细胞周期中的G2/M检查点导致G2期阻滞，且14-3-3σ与p21有互相增强作用[19]。14-3-3也可以通过直接影响WEE-1酶活性控制细胞周期，有研究表明：共表达WEE1和14-3-3β可以提高WEE1激酶的活性，从而引起G2/M阻滞[20]。Ptc1编码的蛋白为跨膜蛋白，能特异地与磷酸化的cyclinB1CRS相互作用，共定位于细胞膜，改变cyclinB1正常的亚细胞分布，由此延迟了正常由活化的cyclinB1/Cdc2复合物介导的有丝分裂事件，抑制细胞的生长增殖[21]。Wang等[22]将表达Gadd45a的载体显微注射入正常人成纤维细胞后，细胞被阻滞在G2/M期。研究发现Gadd45a诱导的G2/M期阻滞是以p53依赖的方式进行的，Gadd45a可在具有核转位功能的B23蛋白的协助下进入细胞核。[23]Gadd45a蛋白的中心区域可与细胞分裂周期基因2(celldivisioncycle2，Cdc2)相互作用，使调控G2/M期的Cdc2-CyclinB1蛋白复合体解离，游离出的CyclinB1蛋白转位出核被迅速降解。新形成Gadd45a-Cdc2复合体不再有细胞周期依赖性激酶作用，从而诱发细胞G2/M期阻滞[24]。2Cdc25家族Cdc25家族是调节Cdk(cyclin-dependentkinase)复合物的磷酸酯酶，通过使Cdk的抑制性磷酸化位点发生去磷酸化而达到调控细胞周期进程的目的。在人类细胞中，Cdc25家族