化妆品微生物检验方法

一、总则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。2.仪器和设备2.1天平。2.2高压灭菌器。2.3振荡器。2.4三角瓶，250mL。2.5玻璃珠。2.6琉璃棒。2.7刻度吸管，1mL、10mL。2.8研钵或均质器。2.9恒温水浴箱。3.培养基和试剂3.1生理盐水成分：氯化钠8.5g蒸馏水加至1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌。3.2SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖1g吐温807g蒸馏水1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3灭菌液体石蜡。3.4灭菌吐温80。4.样品的采集及注意事项4.1所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量。4.2供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。4.3接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。4.4若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。4.5在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。4.6如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。5.供检样品的制备5.1液体样品5.1.1水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10倍稀释法进行。如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1：10检液。5.1.2油性液体样品，取样品10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80,在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液。5.3固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10的检液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加入10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80,70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min。二、菌落总数1.范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。本规范适用于化妆品菌落总数的测定。2.定义本规范采用下列定义菌落总数（Aerobicbacterialcount）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等），1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生总评价的综合依据。3.仪器和设备3.1三角瓶，250mL。3.2量筒，200mL。3.3pH计或精密pH试纸。3.4高压灭菌器。3.5试管：15×150mm。3.6灭菌平皿：直径9cm。3.7灭菌刻度吸管，10mL、1mL。3.8酒精灯。3.9恒温培养箱：36℃±1℃。3.10放大镜。4.培养基和试剂4.1生理盐水：见总则中3.1。4.2卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基4.2.1成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g卵磷脂1g吐温807g蒸馏水1000mL4.2.2制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80,将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，调pH值为7.1～7.4,加入琼脂，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。4.30.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenylterazoliumchloride,TTC）成分：TTC0.5g蒸馏水1000mL溶解后过滤，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。5.操作步骤5.1用灭菌吸管吸取1：10稀释的检液2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000,1：10000，……等，每种稀释度应更换1支吸管。5.2将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL,随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，为空白对照。5.3为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。6．菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5倍～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一个稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2,以代表全皿菌落数。7.菌落计数及报告方法7.1首先选取平均菌落数在30个～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表1中例1）。7.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2,应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表1中例2及例3）。7.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例4）。7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，刚应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例5）。7.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30个～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例6）。7.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU。7.7菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见表1报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。表1细菌计数结果及报告方式例次不同稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数(CFU/mL或CFU/g）报告方式(CFU/mL或CFU/g）10-110-210-31136516420——1640016000或1.6×10422760295461.63800038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044不可计4650513——513000510000或5.1×105527115——270270或2.7×1026不可计30512——3050031000或3.1×1047000——＜1×10＜1×10*CFU：菌落形成单位。三、粪大肠菌群1.范围本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。2.定义本规范采用下列定义粪大肠菌群（Fecalcoliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44℃±0.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。该菌直接来自粪便，是重要的卫生指标菌。3.仪器3.1恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。3.2温度计。3.3显微镜。3.4载玻片。3.5接种环。3.6电磁炉。3.7三角瓶，250mL。3.8试管：15×150mm。3.9小倒管。3.10pH计或pH试纸。3.11高压灭菌器。3.12灭菌吸管，10mL、1mL。3.13灭菌平皿：直径90mm。4.培养基和试剂4.1双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基成分：蛋白胨40g猪胆盐10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐温8014g蒸馏水1000mL制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸馏水中。将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，调pH到7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）。68.95kPa(115℃10lb)20min高压灭菌。4.2伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2%伊红水溶液20mL0.5%美蓝水溶液13mL蒸馏水1000mL制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4,分装于三角瓶内，103.43kPa(121℃15lb)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。4.3蛋白胨水（做靛基质试验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2.分装小试管，103.43kPa(121℃15lb)15min高压灭菌。4.4靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。4.5革兰氏染色液：4.5.1染液制备4.5.1.1结晶紫染色液：结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。4.5.1.2革兰氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸馏水加至300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。4.5.1.3脱色液：95%乙醇。4.5.1.4复染液：（1）沙黄复染液：沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。（2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL,放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL,混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL,即为稀石碳酸复红液。4.5.2染色法4.5.2.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗。4.5.2.2滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。4.5.2.3滴加95%乙醇脱色，约30s,或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s,水洗。4.5.2.4滴加复染液，复染1min,水洗，待干，镜检。4.5.3染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：如用1：10稀释石碳酸复红液做复染，复染时间仅需10s。5.操作步骤5.1取10mL1：10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不