第五章-微生物的生长繁殖与影响因子(revised3)

第五章微生物的生长繁殖与影响因子1主要内容：微生物的生长繁殖细菌的生长曲线细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用影响微生物的环境因子2第一节微生物的生长繁殖3一、微生物生长繁殖的概念（微）生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，微生物细胞不断迅速增长，细胞长到一定程度时，就会由一个细胞分裂成两个子细胞。生长个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加繁殖指生物个体数目的增加4单细胞生物的生长和繁殖细胞分裂=繁殖裂殖、芽殖、孢子繁殖等多细胞生物的生长和繁殖另外，生物的繁殖有无性繁殖和有性繁殖之分。5世代时间（G）①单细胞微生物的世代时间：两次细胞分裂之间的时间②多细胞生物的世代时间：两次繁殖之间的时间世代时间的大小反映了一种微生物繁殖速度的快慢。不同种的微生物，其生长繁殖速度不同。原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快。从一般应用的角度，对于单细胞生物（如细菌），我们常常把生长=繁殖。6二、研究微生物生长的方法1、微生物的培养方法（1）微生物的纯培养及获得方法•在自然环境中生存的微生物，都是混杂的。如果我们希望研究和利用某一种微生物，就需要把微生物分离出来，得到只含有一种微生物的培养，这种在实验室条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。7•为了得到纯培养，可采用显微镜器直接在显微镜下挑取单个细胞进行培养，但通常采用的是稀释涂布法或稀释倒平板法或划线平板法等来分离、纯化微生物。•为了进行纯培养，防止其他微生物的进入是十分重要的，若其他微生物进入纯培养中，便称为污染。•防止污染的方法：器皿的灭菌、环境的控制、操作过程的控制8910（2）微生物的培养方法微生物的培养方法根据培养过程中对氧气的需要与否可分为好氧培养和厌氧培养：①好氧培养方法•试管斜面、培养皿平板•发酵罐11②厌氧培养方法微生物的厌氧培养方法不需要提供氧气，对于厌氧微生物来说，氧气是有害的，因此要采取各种方法去氧或放在氧化还原地位低的条件下进行培养。•在实验室中除了要用特殊的培养装置，还需要在培养基中加入还原剂和氧化还原指示剂。1213142、分批培养和连续培养微生物多是通过培养研究其群体生长。常用的培养方法有：分批培养和连续培养。（1）分批培养•分批培养是将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖；结果会出现微生物数量由少变多，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律。1516细菌的生长曲线各种细菌的生长速率不一，每一种细菌都有各自的生长曲线，但曲线的形状基本相同。其他微生物也有形状类似的生长曲线。废水生物处理中混合生长的活性污泥微生物也有类似的生长曲线。17（2）连续培养连续培养有恒浊连续培养和恒化连续培养两种。a．恒浊连续培养——使培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。•按试验目的，首先确定培养液的浊度保持在某一恒定（用自动控制浊度计测定）。当浊度较大时，加大进乳流速，以降低浊度；浊度较小时，降低流速，降低流速，提高浊度。发酵工业采用此法可获得大量的菌体和有经济价值的代谢产物。18b．恒化连续培养——维持进水中的营养成分恒定(其中对细菌生长有限制作用的成分要保持低浓度水平)，以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物，使细菌处于最高生长速率状态的培养方式。•在连续培养中，微生物的生长状态和规律与分批培养中的不同。它们往往处于相当分批培养中生长曲线的某一个生长阶段。1920生物反应器（用于微生物的连续培养或分批培养，可以控制温度、溶解氧、pH等多项指标）213、生长曲线的各个时期及其特点细菌的生长曲线可细分为6个时期：停滞期(适应期)、加速期、对数期、减速期、静止期及衰亡期。•由于加速期和减速期历时都很短，可把加速期并入停滞期，把减速期并入静止期。因此细菌的生长繁殖可粗分为4个时期。下面分别进行介绍。2223I．停滞期少量细菌刚接入一定量的新鲜液体培养基中，并不立即生长繁殖，需要有一个适应过程（产生适应酶）。此时细胞物质开始增加，但数量不增加或增加很少。•停滞的长短取决于某些因素：接种量、菌龄、营养等。如果接种量大、菌龄小、营养和环境条件好，则停滞期就短。•处于停滞期的细菌对外界环境条件较敏感，易受外界不良环境条件的影响而发生变异。24II．对数期（指数期）细菌的生长速度达到最大，细菌数以几何级数增加，在生长曲线上呈直线关系。•处于对数期的细菌，得到丰富的营养，代谢活力最强，细菌旺盛生长。此时的细菌比较整齐（群体内比较一致）健壮。对不良环境条件的抗性也比较强。25计算世代时间G:已知：t1、t2、X1、X2，①X2=X12nn=(lgX2-lgX1)/0.301由G=(t2-t1)/n，可得：G=0.301(t2-t1)/(lgX2-lgX1)②另一种方法dX/dt=K1X，其中K1为微生物的生长速度常数ln(X2/X1)=K1(t2-t1)；令X2=2X1，则t2-t1=G得：G=ln2/K1即G=0.693/K126III．静止期由于对数期的细菌迅速生长繁殖，消耗了大量的营养物质，同时代谢产物的大量积累对细菌本身产生毒害作用；另外，pH、溶解氧、氧化还原电位等条件也变得不利。结果造成细菌的生长速率逐渐下降，甚至到零。•在静止期，细菌总数达到最大，新生数与死亡数大致相等，保持动态平衡。此时的细菌开始积累贮存物质，芽孢菌形成芽孢。27IV．衰老期营养物质被耗尽，细菌进入内源呼吸阶段（微生物消耗自身的贮存物质进行呼吸）。有害物质大量积累，不利于细菌的生长繁殖，此时，死亡率增加，活菌数减少。细菌常出现畸形或衰退型。从根本上说，细菌的不同生长时期，是由外界提供的营养物的量决定的，即所谓的负荷（F/M）。28三、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理中的应用在污水生物处理过程中，如果条件适宜，活性污泥的增长过程，与纯种单细胞微生物的增值过程大体相仿，也可以存在停滞期、对数期、静止期和衰老期。在处理构筑物中，通常仅出现生长曲线中的某一、二个阶段。且处于不同阶段时的污泥，其特性有很大的区别。29由于废水生物处理（活性污泥）实际是连续运行，其微生物生长规律不同于分批培养时的规律，它只能是处于生长曲线的某一阶段。一般把活性污泥生长曲线的划分成三个阶段：•生长上升阶段、生长下降阶段和内源呼吸阶段。3031•对于常规活性污泥法，是利用静止期（生长下降阶段）的微生物，原因有二：一是对负荷的要求；二是对沉淀性能的要求。•当然也有利用其他阶段微生物的废水生物处理方法，如高负荷活性污泥法是利用对数期（生长上升阶段）和减速期（生长下降阶段），延时曝气法是利用衰亡期（内源呼吸阶段）等等。32微生物代谢速率与负荷的关系废水处理中，通过控制负荷来控制微生物的生长状态。大多数活性污泥处理系统的运行范围33微生物生长测量方法个体计数法重量法生理指标法四、微生物生长量的测定方法可根据菌体细胞量、菌体体积、重量直接测定，也可以根据某种细胞物质的含量或某个代谢活动速度间接测定。341、测微生物总数（1）计数器直接计数（2）染色涂片计数（3）比例计数法（4）比浊法缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；352、测定活菌数（1）平板菌落计数法（CFU）：取定量稀释液，用涂布或倾注平板的方法在固体培养基上培养，计算菌落36（2）液体稀释培养基计数：将待测样品作连续10倍稀释，一直稀释到稀释液的少量接种到新鲜培养基中没有或极少生长。记录每个稀释度出现生长的试管数，再用或然率理论，查MPN（mostprobablenumber，最大可能数量）表，根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。（3）薄膜计数法：如果测定量大而含菌浓度很低的样品（如空气、水）中的活菌数，可将样品用微孔薄膜（硝化纤维素薄膜）过滤，再与膜一起放到培养基或浸透培养液支持物表面培养。373、计算生长量：测细菌重量（1）测细胞干重：一般干重为湿重的20-25%。收集单位体积培养液中菌体，干燥器内加热或减压干燥，直接用仪器测定。（2）测细胞含N量确定细胞浓度：凯氏定氮法测N，总蛋白含量=含N量%×6.25（3）通过DNA测定计算浓度：荧光法，每个菌平均含DNA8.4×10-5ng（4）生理指标：测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或二氧化碳产量。38五、微生物死亡的测定•微生物的死亡，意味着不可恢复地失去生长与分裂繁殖的能力。•对于一个不是受机械性破坏的微生物细胞来说，死亡一词仅仅是就测定细菌活力所用的条件而言的。•问题：培养方法的可靠性39第二节微生物的生存因子•微生物除需要营养外，还需要合适的环境生存因子。如果环境因子不正常，会造成微生物生命活动不正常，甚至变异或死亡。主要环境因子包括温度、pH值、氧化还原电位、溶解氧、渗透压及活度等。40一、温度温度对生活机体的影响表现在两方面：一方面是随着温度上升，细胞中生物反应和生长速率加快，另一方面蛋白质、核酸等可能在高温下被破坏。每种微生物都有最低生长温度、最高生长温度、最适生长温度、致死温度。各种微生物最适温度不一致，可将微生物分为嗜冷菌、嗜中温菌、嗜热菌、嗜超热菌。大多数细菌是嗜中温菌。嗜热菌和嗜超热菌是特殊微生物，细分为：专性嗜热菌、兼性嗜热菌、超嗜热菌。41温度对微生物生长速率的影响42微生物类型最低温度最适温度最高温度嗜冷菌-5～05～1020～30嗜中温菌15～2020～4545～50嗜热菌3050～6070～80嗜超热菌6570～105110～11343极端温度对于微生物的影响极端温度分高温和低温，影响有所不同。高温的影响•在高温时，微生物的蛋白质会发生凝固变性，呈不可逆变性，导致微生物的死亡。•通常可以用高温对于微生物的影响来达到杀灭微生物的目的。44灭菌是指杀死一切微生物；•高温灭菌的方法：灼烧、干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌，一般为160oC，2h高压蒸汽灭菌条件：一般为121oC，20min•灭菌的效果取决于细菌中最耐热的结构——芽孢。消毒是指杀死致病微生物。•高温消毒的方法：煮沸、巴氏消毒法等。防腐:阻止微生物的生长繁殖。45锅顶压力蒸汽灭菌器4647低温的影响：低温下，微生物的代谢活力低，生长缓慢或停止，但不致死。处于低温下的微生物，一旦获得适宜的温度，即可恢复活性。利用这一特性，各类冰箱成为生物实验中保存生物样品或试剂的重要手段。•一般冰箱的温度在4oC~-18oC，可以用于保存一般的生物样品。•有的样品需要比较低的温度，甚至达到-70oC，或更低（如使用液氮，可以达到-196oC）4849二、pH环境中的pH对微生物生命活动影响很大：①引起细胞膜电荷的变化，影响微生物对营养物质的吸收②影响代谢过程中酶的活性③改变生长环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性微生物对于pH的要求也存在最高、最低和最适三个点。50不同微生物生长所需的pH不同。大多数微生物最适pH6.5-7.5，适应范围在pH4-10之间。•能在pH1-5范围内生长的微生物称为专性嗜酸微生物，如氧化硫硫杆菌、酸热硫化叶菌；•能在酸性条件下也能在中性条件下生长的为兼性嗜酸微生物；•能在高pH下生长的为嗜碱性微生物，如巴氏芽孢杆菌能在pH11.2-11.6条件下生长（最适pH9.6）。51在废水生物处理中，pH一般在6.5-8.5（6-9）。生物处理的主体是细菌，它要求pH略为偏碱。过高的pH会使原生动物呆滞，菌胶团解体，影响去除效果，而过低的pH，会使霉菌大量繁殖，造成污泥膨胀。微生物最低pH最适pH最高pH细菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-852在培养微生物的过程中，随着微生物的生长繁殖和代谢进行，pH会变化：碳源：葡萄糖、乳糖→有机酸——pH下降氮源：蛋白质、蛋白胨、氨基酸→氨、胺类——pH上升（NH4）2SO4→SO42-——pH下降Na2