还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定

还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定关键词：还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSG测定2009-04-2400:00来源：互联网点击次数：6147GSH和GSSG参照Anderson等（1992）。取0.5g样品，加入3mL冰冷的6%的偏磷酸（含1mmol•L-1EDTA，pH2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000g，4℃离心15min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20℃下等待测定。总的GSH和GSSG含量测定如下：200μL提取液加1.2mL反应液包含400μL反应液1（110mmol•L-1Na2HPO4•7H20，40mmol•L-1NaH2PO4•H2O，15mmol•L-1EDTA，0.3mmol•L-15,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoicacid）DTNB，0.04%BSA）、320μL反应液2（1mmol•L-1EDTA，50mmol•L-1imidazole咪唑solutionand0.02%BSA）、400μL反应液3（5%Na2HPO4，pH7.5的溶液稀释50倍）、80μL9.0mmol•L-1NADPH。测定OD412下的吸收值。GSSG含量测定如下：200μL提取液加入1mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1h再测定OD412下的吸收值。GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。GSH测定方法：取样品0.5g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。取50μL上清液，用5%磺基水杨酸定容至100μL（即加入5%磺基水杨酸50μL），加入24μL1.84mol•L-1三乙醇胺triethlenediamine以中和样液，加入50μL10%乙烯吡啶Polyvinylpyridine（用70%乙醇配制），25℃水浴1h，以除去GSH，到时加入706mL50mmol•L-1磷酸缓冲液，pH7.5，内含2.5mmol•L-1EDTA，加入20μL10mmol•L-1NADPH和80μL12.5mmol•L-1DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10min，到时加入20μL50U•mL-1GR，总体积为1mL，立即混匀，读出3min时的OD值。此法用来测定GSSG，总的谷胱甘肽（GSH+GSSG）的测定，只要把上述的乙烯吡啶用等体积的蒸馏水替代即可。以5%磺基水杨酸为溶剂，用同样的方法制作GSSG标准曲线。叶绿素含量的测定参照Arnon（1949）的方法。从选取第二片完全展开叶，剪碎，称取0.1g置于研钵中，加少量80%丙酮研磨成匀浆，定容至25mL，摇匀并置于避光处，待残渣发白后过滤，以80%丙酮作为对照，在663nm和645nm下读取OD值。样品中叶绿素含量（mg•g-1FW）的计算公式为：叶绿素a含量=0.25（12.7OD663-2.69OD645）；叶绿素b含量=0.25（22.9OD645－4.68OD663）。