Westernblot所需溶液的配制

WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Runningbuffer)5×Trisbase15.14gGlycine(甘氨酸)72.0gSDS5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1gTris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。使用前，将5×稀释到1×：取200ml5×，定容到1000ml。2转膜缓冲液（Sendingbuffer）（现用现配）1000ml1500mlGlycine(甘氨酸)14.413g21.6g1.0MTris.HCl(pH8.3)25ml37.5ml10%SDS1ml1.5ml甲醇(methanol)200ml300ml蒸馏水溶解至1000ml溶解至1500ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加SDS。310%SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（SodiumDodecylSulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液:10gSDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。4Tris.HCl的配置1.0MTris.HCl(pH8.8)Tris30.28g加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5MTris.HCl(pH8.8)Tris45.43g加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0MTris.HCl(pH6.8)Tris30.28g加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0MTris.HCl(pH8.3)Tris30.28g加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。注：Tris的分子量是121.4.4度储存。510%APS(Ammoniumpersulfate;过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。610×TBS(Tris-bufferedsaline)的配置NaCl80g160gTrisbase24g48g双蒸水溶解至1000ml溶解至2000ml加HCl调pH到7.6，室温储存。7TBST(Tris-bufferedsalinewithTween20)的配置10×TBS100ml200mlTween201ml2ml双蒸水溶解至1000ml溶解至2000ml室温储存。8上样缓冲液（loadingbuffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。9stackinggelbuffer(4×)Trisbase:0.5M5ml1MTris.HClSDS(w/v):0.4%0.4ml1%SDS调pH到6.8，加双蒸水到10毫升。105×Samplebuffer(10ml)Stackinggelbuffer5mlSDS1.0g巯基乙醇2.5ml（最后再加）甘油（glycerol）2.5ml溴芬兰（SigmaB-8026）2.5mg室温储存11封闭液的配置Blockingsolution要用TBST配制牛奶5%(w/v)nonfatdriedmilk或者1%BSA0.01%antifoamA(Sigma)0.01%(v/v)sodiumazide12丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。1）4%多聚甲醛（PFA）的配制（1000毫升）40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10×PBS，加水定容到1000毫升。调pH到7.2-7.4。通风橱过滤，4度保存。13组织裂解液10mMTris-HCl(pH7.4)48.44mg粉末或1MTris-HCl0.4ml150mMNaCl350.6mg1%TritonX-1000.4ml100%1%去氧胆酸钠（Sodiumdexycholate）400mg5mMEDTA74.4mg或0.25MEDTA3.2ml1%SDS10%SDS0.4mlPMSF(难溶解)7mg蛋白酶抑制剂1片/10ml步骤：首先加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH使溶解，再调pH至7.4；然后分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应戴口罩。14.PBS的配制（1000毫升）（PH7.2~7.4）NaCL8.00gKCL0.20gNa2HPO4.12H2O（或Na2HPO4.H2O)3.455g或（1.56g）KH2PO40.20g