实验九-卵磷脂的提取和鉴定

实验九卵磷脂的提取、纯化和鉴定1、学习和掌握卵磷脂的提取和鉴定方法；2、掌握薄层层析的原理、方法和应用。一、实验目的是细胞膜磷脂双分子层的重要成分。卵磷脂又称磷脂酰胆碱，是甘油磷脂的一种。在动植物体内均有分布，在动物的脑、精液、心、肝、肾上腺和卵细胞中含量较多，蛋黄中含量可达8-10％。其结构式为：胆碱HO磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿，部分溶于乙醇，极难溶于丙酮；卵磷脂溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂，但不溶于丙酮；丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。因此，本实验用乙醇、乙醚为溶剂，丙酮为沉淀剂，干燥后获得卵磷脂。新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈黄褐色。卵磷脂中的胆碱，在碱性溶液中可分解为三甲胺，而具有特异的鱼腥味，可用于鉴定。二、实验原理（一）卵磷脂的提取和纯化物质提取、纯化受到多种因素的影响，如抽提物的种类及其配比、抽提条件（温度、时间等）都能影响提取的结果。这种多因素的试验可以通过正交法，即用一特制的表格—正交表来安排试验，计算和分析试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。本实验运用正交法抽提物的种类及其配比、时间温度和料液比这4个因素对卵磷脂提取和纯化的影响，并求得在什么样的条件下可以达到最佳的试验效果。正交法实验设计水平影响因素[乙醇]∶[乙醚]温度时间（min）料液比15∶14℃101∶424∶125℃201∶533∶160℃301∶6表1抽提物、温度、时间和料液比4因素3水平表3L9表按一般方法，如对4个因素3个水平的各种搭配都要考虑，共需做3*3*3*3=81次试验，而用正交表只需做9次试验，即选用L9表(L是正交表的代号，下标数字表示试验次数)。试验号影响因素试验结果[乙醇]∶[乙醚]温度时间（min）料液比115∶114℃11011∶4215∶1225℃22021∶5315∶1360℃33031∶6424∶114℃22031∶6524∶1225℃33011∶4624∶1360℃11021∶5733∶114℃33021∶5833∶1225℃11031∶6933∶1360℃22011∶4I（I水平试验结果总合）II（II水平试验结果总合）III（III水平试验结果总合）I/3II/3III/3级差表4试验安排将本试验的4个因素依次放在L9表的第1，2，3，4列，再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，就得到上表的试验安排。（二）薄层层析薄层层析（TLC）是一种微量而快速的层析方法。其层析是在吸附剂（固相支持物）均匀涂布的的薄层上进行的，故称薄层层析。而待分析的样品，是点加到薄层板的一端，然后将该端浸入适宜的展层剂中，在密闭的层析缸中展层。由于各种物质的结构和性质的不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。吸附力大的易被吸附剂吸附，而较难被展层剂所解吸。吸附力小的则不易被吸附剂吸附，而易被展层剂携带至较远的距离。这样，各种物质在吸附剂和展层剂之间反复多次的被吸附与解吸附，就表现出不同的迁移率而得以分离，并可以通过与显色剂的显色反应而得到鉴定与区分。（一）卵磷脂的提取和纯化1、实验材料：鸡蛋黄2、仪器：恒温水浴锅蒸发皿漏斗磁力搅拌器天平3、试剂：95％乙醇乙醚丙酮三、实验材料、仪器和试剂1、实验材料：提取的卵磷脂2、仪器：电热鼓风干燥箱、层析玻璃板、层析缸、吹风机、小型喷雾器。3、试剂：（1）硅胶-G；（2）0.2%羧甲基纤维素钠溶液；（3）展层剂：氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4)；（4）显色剂：1%碘液。（二）卵磷脂的薄层层析1、卵磷脂的粗提蛋黄10g放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇40ml，搅拌15min后，静置15min；然后加入10ml的乙醚，搅拌15min后，静置15min；过滤；滤渣进行二次提取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1)的混合液30ml，搅拌、静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷脂粗品。四、实验步骤（一）卵磷脂的提取2．卵磷脂的纯化取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10%的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10%的ZnCl2水溶液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。（二）卵磷脂的薄层层析1、调浆：称取硅胶-G4.5g→烧杯→12ml0.2%羧甲基纤维素钠溶液→用玻璃棒调匀搅拌为浆状液。2、涂布：取洁净、干燥玻璃板一块→下衬一张白纸→在桌面上放平→用烧杯将浆状物均匀倒在玻璃板上，从一端开始，保持均匀一致，涂布面积1～4/5。3、干燥：在室温下凉干2分钟→60℃干燥箱烘30分钟。4、活化：将干燥箱升温至120℃，活化30分钟后，关闭电源，当玻璃板面温度降至不烫手时取出。5、点样：样点距玻璃板一端下缘1cm，相互间隔1～1.2cm；每位点重复点五次，每次用冷风吹干后再点，每次点样直径不超过2mm。6、展层：在层析缸中加入展层剂0.5cm深，加盖平衡30分钟，将点样端浸入，密闭展层10-30min。后取出薄层板，标出展层剂前沿位置，用电吹风热风将薄层板吹干。7、显色：用喷雾器向薄层板上均匀喷洒1%碘液溶液，热风吹干至色斑显现。五、实验结果1、卵磷脂收率卵磷脂收率=卵磷脂粗品重量/蛋黄重量×100%2、计算各组分的Rf值3、判断卵磷脂粗提物的组分四种磷脂标准品的Ｒf值分别为:溶血卵磷脂0.18；神经鞘磷脂0.33；卵磷脂0.65；磷脂酰乙醇胺0.96OABCDO1O2E六、思考题：1、简述卵磷脂的生物学功能。2、磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇胺（脑磷脂），磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇的结构式。3、何谓薄层层析？其原理和方法？4、制备硅胶-G薄层板与点样时应注意些什么问题？5、本实验中，哪一种组分的Rf值大一些？为什么？