冷冻电子显微镜技术

冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用北京大学医学部生物物理系汪国良摘要冷冻电子显微镜技术的快速发展，使其在生物大分子的结构研究中得到越来越广泛的应用。对于具有二维晶体结构的生物样品，能够得到其高分辨率的三维重构图像，并直接用于解析其空间结构信息；对于非晶体的样品，虽只能得到低分辨率的三维重构图，但可以为高分辨率的X-射线晶体学和核磁共振波谱学所得到的亚结构提供模型。此外，通过捕获样品在不同状态的结构信息，研究其构象的动态变化与其功能的关系。本文从样品准备、数据采集、数据处理等步骤，对冷冻电子显微镜技术在生物大分子的三维结构研究中的应用进行综述，并举例说明这项技术的优越性。关键词冷冻电子显微镜、电子晶体学、单颗粒、电子断层学、三维重构冷冻电子显微镜技术（cryoelectronmicroscopy）是从20世纪70年代提出的，经过近10年的努力，在80年代趋于成熟。它的研究对象非常广泛，包括病毒、膜蛋白、肌丝、蛋白质核苷酸复合体、亚细胞器等等[1]。一方面，冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品既可以是具有二维晶体结构的，也可以是非晶体的；而且对于样品的分子量没有限制。因此，大大突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究小分子量（小于100KDa）样品的限制。另一方面，生物样品是通过快速冷冻的方法进行固定的，克服了因化学固定、染色、金属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的生活状态。现在，冷冻电子显微镜都具备自动图像采集系统。CCD(charged-coupledevice)照相机能快速、动态的记录电子衍射图，但由于像素的限制，其分辨率不如照相胶片。CCD和照相胶片所记录的是生物样品空间结构的二维投影，利用各种计算机软件程序包，可以从电镜的二维图像重构样品的三维结构，即三维重构。现已开发出许多软件程序包可供计算机处理使用，大大方便了生物样品的结构重构[2]。一、样品准备用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又能抗脱水、电子辐射。一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。该方法有两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近“生活”状态，不会因脱水而变形；减少辐射损伤；而且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分子结构信息，了解分子功能循环中的构象变化[3]。另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezingequipment），利用结合底物混合冰冻技术(spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来(ms量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。[4]。二、数据采集冷冻的样品通过专门的设备——冷冻输送器转移到电镜的样品室。在照相之前，必须观察样品中的水是否处于玻璃态，如果不是则应重新制备样品。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，照相时必须使用最小曝光技术（minimalexposuretechnic）。要得到高分辨率的电镜图像，照相时累积的电子剂量不能超过临界剂量1000到2000e-nm-2;中等分辨率的电镜图像图像不能超过临界剂量10000e-nm-2。最小曝光技术要求首先在低放大倍数下寻找合适的区域；光学对位和聚焦应在邻近照相的区域进行[5]。一般情况下，用感光胶片记录图像。感光胶片和CCD记录的都是样品在垂直于电子束方向的二维投影像。由于象素的限制，SSCCD(slow-scancharged-coupleddevice)照相机拍摄的图像的分辨率不能和胶片记录的图像相比较，但是能更快速的反馈信息，因为胶片只有从电镜中取出，经化学处理后才能观察。而且SSCCD在记录动态变化、线性、背景噪音等方面优于感光胶片[6]。一些因素如：辐射损伤、电子束诱导的样品漂移和放电、电子束不均一等都能引起图像质量的下降。低剂量照相技术能尽可能的减少电子束辐射损伤；而将样品保持在液氦的温度能进一步的保护样品。具有200KV或更高加速电压并装备场发射枪（fieldemissiongun）的现代电镜较100kv加速电压和热发射枪（thermionicelectrongun）的传统电镜有很大的优越性。场发射枪产生的电子束具有更好的时间、空间一致性，提高CTF；高加速电压能减少电子束诱导的样品漂移和放电[7]。冷冻含水生物样品由于没有经过化学固定、染色、金属镀膜，所获得的图像反差小。冷冻含水样品电镜图像的反差取决于样品本身的散射反差、冰的厚度和物镜的欠焦量等因素。样品本身的散射反差与样品结构有关，是无法改变的。冰层过厚与支持膜过厚一样会降低反差，因此其厚度必须适当。改变物镜欠焦量可以改变图像的反差。欠焦下得到图像在光学上是失真（opticaldistortion）的（用CTF描述），在进行中、高分辨率的图像分析时必须校正。在任何欠焦水平，总有一些图像信息会丢失，因此需要在不同的欠焦水平下拍摄大量图像，加以合成以弥补单一图像丢失的信息[8]。三、图像处理及三维重构数据处理的最终目的是为了获得生物样品的三维质量密度图。由于冷冻电镜获得图像信躁比低，结构信息常常淹没在躁声中而难以辨认。只有通过大量拍摄生物样品的同一个图像，然后用某种方法加以平均来消除躁声。由二维图像推知三维结构的方法即三维重构。其理论原理是中心截面定理:即一个函数沿某方向投影函数的傅里叶变换等于此函数的傅里叶变换通过原点且垂直于此投影方向的截面函数。在1968年由DeRosier和klug提出。由于样品的性质和有无对称结构的不同，图像分析的方法也有差异。但对于所有的生物样品都有三个基本的任务要解决：第一，必须得到不同方向的样品图像；第二，计算确定样品的方向和中心并不断加以优化；第三，无论在傅立叶空间还是真实空间，图像的移位必须加以计算校正，以使样品所有的图像有共同的原点[1]。基于以上几点，人们建立了三种解析生物大分子的基本方法。一是电子晶体学（electroncrystallography）,利用电子与晶体的相互作用研究生物大分子的结构。二是单粒子法（singlepaticleanalysis）,根据大量不同取向的相同颗粒的电子显微图像，重构生物大分子的结构。三是电子断层学（electrontomography）,根据样品在一系列不同的倾斜角度下的多个电子显微象进行三维重构。1、电子晶体学在冷冻电子显微镜这三种方法中，电子晶体学是唯一需要二维晶体或者螺旋对称的生物大分子作为样品。因此，形成二维晶体是该方法的限速步骤。通常从二维晶体电子衍射图中得到衍射振幅，从显微图像中确定相位；然后处理一批倾斜和未倾斜样品的衍射图像和显微图像，并加以平均以确定一套完整的三维振幅和相位数据集。最后利用振幅和相位的数据集进行三维重构[9]。能形成二维晶体的膜蛋白是电子晶体学的主要研究领域。一些膜蛋白如：细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）、光和复合体-II(light-havestingcomplexII)、嗜盐菌紫质(halorhodopsin)、视紫红质（rhodopsin）等的三维结构相继被解析，并且接近原子级的分辨率[7]。2000年，首次得到了人类红细胞上0.38nm分辨率的水通道AQP-1(Aquaporin-1)的的三维结构[10]。利用脂单层作为模板，一些可溶性蛋白或小蛋白复合体也可以形成晶体供电子晶体学研究。αβ微管蛋白二聚体的结构就是利用这种方法解析的[11]。具有螺旋对称结构的样品，如肌动蛋白丝、微管等，通常只需要拍摄一张图像即可，而不必倾斜拍摄。因为它的一张二维图像就包括了所需要的各个角度的信息，并且在分辨率上是各向同性的。但由此重构的三维图像的信躁比低。能形成管状晶体结构的钙泵（Ca2+ATPase）已经获得0.8nm分辨率的三维结构，能清楚的辨认出该蛋白的10个跨膜α-螺旋，其中的4个与细胞质部分相连[12]。2、单粒子法单粒子法不需要样品具备晶体结构，这大大拓宽了其研究领域，使生物大分子及其复合体的构象研究成为可能。单粒子方法目前发展了多种处理流程，比较成熟的有两种一种是J.Frank等建立的“随机锥形数据采集法”(random—conciledatacollectionmethod)；另一种是vanHeel等建立的“角重组法”(angularreconstitutemethod)。前者需要将样品倾斜不同角度拍摄一组电镜照片，要求颗粒在电镜照片上有一定的取向优势；后者不要求这种取向优势，而且只需要拍摄一张“零倾斜”(zerotilt)的照片。在获得初步的三维重构体后，还可以用“投影匹配方法”(projectionmatching)进行角度的微调以提高分辨率。理论上角重组法是一种无偏的方法，而且有广泛的通用性。溶液中的粒子取向完全是随机的，因而具有6个自由度，即3个平移自由度X、Y、Z和3个旋转自由度α、β、γ。设想电镜图像是粒子沿Z方向的投影，对于每一个粒子的图像则有5个参数需要确定：两个平面内的平移自由度X、Y,一个平面内的旋转自由度γ，两个离开平面的旋转自由度α、β。平面内自由度可以通过对位加以消除。每个分子离开平面的旋转自由度提供了分子的三维信息，因而在进行三维重构之前必须加以确定。单粒子的图像处理的目的就是确定资料中每一个粒子的这些参数[13]。单粒子法冷冻电子显微镜3D重构一般包括以下步骤[14]：①玻璃态样品的准备。②粒子的采集。选择颗粒平均分布的样品区，进行定位和拍照。为了获得高分辩的结果，需要采集大量的粒子，对于那些无对称性的结构尤其如此。如在分析核糖体结构时，为达到1.5nm的分辩率，需要采集29000个粒子的图像，而要使分辩率达到1.15nm,则要70000个粒子。按此推算，要达到原子分辨率，需要采集上百万个粒子，其工作量之大可以想见。因此，粒子采集构成了单粒子三维重构工作的瓶颈。③粒子参量的确定与分类。不同粒子之间的空间关系的确立：三个欧拉角(Eulerianangle)确定方向；2个平移元素确定粒子的位置。粒子分类不仅将大量的原始资料压缩成若干类，而且在分类的过程中经过平均消除了噪声。④3D重构。一张薄样品的透射电镜图片就是该样品沿着光轴方向的2D投影，逆傅立叶转换（reverseFouriertransformmethod）和背投法(back-projectionmethod)都可以用不同方向粒子的图像重构3D结构。当拥有大量优质的二维投影图像，并且知道它们之间的相互关系，就可以用角重组法进行三维重构。角重组法的基本原理：同一个三维对象的两个不同二维投影之间总能找到一个共同的一维投影。⑤粒子参量的优化。在基于模型的优化方法中，初始重构的投影被用来优化粒子参量，新计算出来的重构图像又被用于下一轮的优化。如此反复，直到模型投影和原初的图像重合。⑥提高分辨率。在冷冻电子显微镜中，轻微的欠焦经常被用来增加生物样品的图像反差。虽然样品更易于观测，但图像的傅立叶转换须经过CTF(contrasttransferfuction)调整。为了得到高分辨率的重构图像，不仅相位要调到预定的分辨率区域，幅度也要调整以补偿CTF经过区域的减少效应。⑦分辨率评估和结构解析：重构图像的有效分辨率是通过确定在作为分辨率功能的相应空间的两个独立的重构图像的一致性而评估的。运用单粒子法，一些生物样品如病毒：抗菌素Φ29；无或低对称的粒子：大肠杆菌70S核糖体等的三维重构图已经得到，虽然目前的分辨率还不是很高。单粒子法还具有研究分子动力学行为的优势，如生化反应可以通过快速冰冻中止，以获得反应中间步骤的图像，进而3D重构获得分子的动态构象变化[15]。抗菌素HK97的工作很好的说明了分子动力学行为的研究,HK97从