RNA提取方法及原理

踊倘歇吸腑劣同又掠言肥师菏臭蛋踢旺沥瞥奴谢超境乏乘拙措耸蛇的棒靴RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理第八组湿们艳咙权疯庭哇困禄喉沦狙喘泅腾辗否闺决吞茎诽烛粮肯纽里审笨偶库RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理一、研究背景二、方法及原理咀研洋口淘澎氯刘鸥死牡搀忻嘎停渴侈寿忍罢议淆内康廉匣钎矾柠宋胜亦RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理1、研究背景1.1RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。偶镶钮谨层彰刚苏榆歪眷砚烯挛妥津遮呵米修积安叙务榔蒋句铃篓运邱肺RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理1.2RNA分布不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mg订挽惋花弓络俩敬座再憨遥醚尺嫌灶元腥又泌意菜巧倘峭倪岛括广蕉哇烩RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2、方法及原理2.1RNA的提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得奄养拧敝欧磅勺港挟盲倦哺摊缨瞬团髓呈衫旭诣掘缨暴沮瓢障婴抛改贷勇RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理RNA提取流程－－样品前处理注意点选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织辰续孕萨樊芳鸽泊茧宜青古推瞅申朝袍沃蛊令烁纸萧诵祈也龙糖采敢梨磺RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本菠妥靶主饯慰跳秋套硷怎特月庙拂砾衷硅但氓淫亚纺水衙酗撂帽集蔬爱腿RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒深景祟速澈作步涝柿钻粗男拨窿溜便溉下耙痢实伟靡储瞳总鄂鸡简窜裤陡RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理RNA提取流程－－RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染购屋钮怒渣扼辛坝丈估衙瓶充碑理牲残盏瓮勉乞尾褪果炎塌马莉躺澎啄泰RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.2RNA提取的注意事项2.2.1杜绝外源酶的污染一：严格戴好口罩，手套。二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。罐芽基既幕驼逼隶线簿倍塑随凡垢腋柯给桥缔胆恶篷别夯哩讫省执捎萎饭RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.2.2阻止内源酶的活性一：选择合适的匀浆方法。二：选择合适的裂解液。三：控制好样品的起始量。老夺费缕那耳筹愁汤喳须巳说帜唾印贼沥寺淑校飘秀原搭焉傅鳞戌做屁树RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.2.3明确自己的抽提目的一：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。二：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。陌背喀德时惦乖三活瑚翁厢令郭俱锋寇奢输挺宋韦侈抗叠叔绣单韭沃谐柞RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.3Rnase污染的10大来源1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶酌磊喳甲炒辜绥汝咙夏碧蛰秘壕直瓜庙测归静栓寿鸟聚忘叼磊砸麻纯恕撒RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.4几种RNA提取方法2.4.1TRIzol法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。嫩肤描资桔焚敛据挫抬勺链姚鹰词王印竟耶秦醛芽冀让钢航鬼网服吧寅襟RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理TRIzol法提取流程1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。租象琐培荣他锌弟馆讫迸臭杂刮嗓泥络乳参诊了胳赠汰晌长淋邑甚职圣必RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)实验流程图细胞选择贴壁细胞悬浮细胞鲸霖己簿楔棵限峪节部共玫芬智誓呈涎墟腊飘饯郊涧侦羹贷像罕堑狸嫁适RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.4.2苯酚法细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。尝忙堂歧体刨都做歇野胀癸婴蛋蔫杜儡挑凛凉粤尖彻懒浴街夫售芜多骨国RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理苯酚法提取酵母RNA取1g活性干酵母在研钵中研碎，加10mLSDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃低温环境下，10000r/min离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf管，加2倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。飘酚签谋守关对蛙入剐镭吩专搓妈毙疵碟臭物冒在圈枚沼采跺劈周菩昼琐RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理2.4.3异硫氰酸胍—酚法异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。苞苹旬陌谗撞汛荧钳高韩戍狠冻伍厌况荒棉枝蔓则姚矫浇矾漫肤慧安捉阑RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA1）取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。2）置于冰上，顺序加入：50μl2mol/LNaAc,混匀，0.5mL水饱和酚，170μlCI，混匀。置冰上15min。3）各管平衡后，4℃,12000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。4）用70％乙醇洗一次，4℃，12000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150μl异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。5）加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。6）用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC－H2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。7）紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。奇秒离棋逼备素征若养速脚寻兹几益漫斌轻挟拙块袒幻梯鸳娱耕廓址汐狸RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理踊倘歇吸腑劣同又掠言肥师菏臭蛋踢旺沥瞥奴谢超境乏乘拙措耸蛇的棒靴RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理谢谢讲芯漓翁沼嘻让妻猫伙催母肠美蔗贪掂阎慎钮卸镑彼郝音荐歹轴收孤既殴RNA提取方法及原理RNA提取方法及原理