酵母双杂交系统(精)

酵母双杂交系统扬州大学生物科学与技术学院酵母双杂交系统应用•鉴定新的蛋白与蛋白相互作用•鉴定蛋白级联底物•鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响•在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质(反向双杂交系统)酵母双杂交的原理•利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型•利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白•通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用•使用不同的培养基筛选阳性克隆酵母双杂交模型DNA-BindingDomainBaitProteinPreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite模型文库筛选的步骤•将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒•将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母•再将文库质粒转化到酵母中•通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白序列分析•从酵母中分离质粒然后转化E.coli•从大肠杆菌中提取质粒并测序•在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性报告基因•LacZreporter-Blue/WhiteScreening•HIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)•LEU2reporter-ScreenonLeu+media•ADE2reporter-ScreenonAde+media•URA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)质粒构建•在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的DNA结合域前面的多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒•诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2,Ura3,orTrp1等。质粒样品FromGolemisLabHomepage假阳性的问题•假阳性是酵母双杂交系统的最大问题•假阳性通常由以下原因造成:1.prey蛋白的非特异性结合2.无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因）假阳性的去除•通过序列分析去除•质粒消除实验剔除假阳性•重新转化含有诱饵质粒的酵母株或不含诱饵质粒的酵母株，分析两种情况后去除假阳性•利用一个不相关的蛋白作为诱饵蛋白测试相互作用•两不或多步筛选酵母双杂交的优点•快速获得相互作用蛋白的基因•只需单一步骤的质粒构建•在体内鉴定蛋白的相互作用•弱小的，暂时的相互作用也能鉴定•能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号酵母双杂交应用举例•蛋白级联底物的鉴定•钙调蛋白与L-异天冬氨酰甲基转移酶的相互作用•E2F1突变子的遗传特性•多肽荷尔蒙受体相互作用•Pha-4在线虫C.elegans中的相互作用参考文献•Bartel,Paul,C.Chien,R.Sternglanz,S.Fields.“EliminationofFalsePositivesthatAriseinUsingtheTwo-HybridSystem.”Biotechniques(1993)Vol.14,no.6,p.920-924.•Chien,Cheng-ting,P.Bartel,R.Sternglanz,S.Fields.“Thetwo-hybridsystem:Amethodtoidentifyandclonegenesforproteinsthatinteractwithaproteinofinterest.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)Vol.88,p.9578-9582.•Fields,Stanley,O.Song.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature(1989)Vol.340,p.245-246.•James,Philip,J.Halladay,E.Craig.GenomicLibrariesandaHostStrainDesignedforHighlyEfficientTwo-HybridSelectioninYeast.Genetics(1996)Vol.144,p.1425-1436.•Kamada,S,H.Kusano,H.Fujita,M.Ohtsu,R.Koya,N.Kuzumaki,Y.Tsujimoto.Acloningmethodforcaspasesubstratesthatusestheyeasttwo-hybridsystem:Cloningoftheantiapoptoticgenegelsolin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)Vol95,p.8532-8537.•O'Connor,Mirriam,C.O'Connor.ComplexInteractionsoftheProteinL-IsoaspartylMethyltransferaseandCalmodulinRevealedwiththeYeastTwo-hybridSystem.TheJournalofBiologicalChemistry(1998)Vol.273,p.12909-12913.•Staudinger,Jeff,J.Zhou,R.Burgess,S.Elledge,E.Olson.PICK1:APerinuclearBindingProteinandSubstrateforProteinKinaseCIsolatedbytheYeastTwo-HybridSystem.TheJournalofCellBiology(1995)Vol.128,p.263-271.Referencescontinued•Vidal,Marc,P.Braun,E.Chen,J.Boeke,E.Harlow.GeneticCharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)Vol.93,p.10321-10326.•White,Michael.Theyeasttwo-hybridsystem:Forwardandreverse.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)Vol93,p.10001-10003.•Zhu,Jianwei,C.Kahn.Analysisofapeptidehormone-receptorinteractionintheyeasttwo-hybridsystem.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)Vol.94,p.13063-13068.•LabofEricaGolemis•SpecialthankstoDr.SusanMangoandtheUniversityofUtah