荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移技术Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET1.荧光共振能量转移的基本概念与理论受体研究技术化学技术免疫共沉淀放射配基结合分析物理技术X-射线衍射核磁共振电子显微镜这些技术要求较大量的样品常常只能在非生理条件下完成很难观察到实时的（realtime）分子间的反应荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术是一种物理技术用分子生物学技术可将待研究分子进行荧光蛋白标记并在细胞表达研究受体-配基的相互作用测定受体-配基相互作用的距离测定受体亲和常数受体二聚化受体构象变化该技术的最显著特点是在平衡条件下，无需分离游离配基和结合配基,即可测定平衡常数RBA技术需要分离游离配基和结合配基荧光共振能量转移技术FRET的优点高灵敏度：现在可以用此方法在溶液中或单细胞水平研究单个受体分子可以和许多技术结合：如显微镜、流式细胞计、共聚焦显微镜、稳态和瞬态荧光光谱，在生理条件即活细胞状态下，选择性地研究分子间的相互作用可以从商业上得到各种荧光探剂:用它们可以标记各种所要研究的无荧光特性的分子如配体，因而大大地开阔了研究途径1.1荧光与荧光光谱分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0(electronicgroundstate)的最低振动能级吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这－过程发生在10-15s时间内被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光荧光与荧光光谱由于从S1的各振动能级回到S1的最低振动能级以非辐射过程丢失能量，所以发射的荧光（从S1的最低振动能→S0的各振动能级）总是比吸收的光能能量低。发射的荧光光谱总是向激发光谱能量较低的方向移动，荧光光谱的峰位向激发光谱的长波方向移动。吸收或激发时形成光谱，主要是由于分子不只是吸收单一波长的光,而是对一定波长范围的光都有吸收，但它对不同波长的光吸收几率不同，因此形成光谱。同样，吸收了光的分子从S1回到S0的各振动能级几率也不同，因而发射的荧光也是一个光谱即荧光光谱。主要荧光与荧光光谱并不是所有的分子都能发荧光，因为某些分子吸收光能以后，以非辐射的形式如碰撞丢失激发能，因而这些分子不发荧光。在受体研究中，如果受体或配体有一个不发荧光，则必须用荧光探剂进行标记，使其均具有荧光性质。荧光与荧光光谱荧光强度随时间衰减，即荧光有一定寿命荧光强度I的衰减随时间呈现指数衰减规律式中I(t0)为t=0时的荧光强度，I(t)为t时间的荧光强度，为荧光寿命当t=时，I(t)=I(t0)e-1,所以,荧光寿命的定义是用光脉冲激发荧光物质以后，荧光强度衰减为I(t0)/e所需要的时间τ的长短和物质本身的性质有关，也决定于其周围环境/0)()(tetItI荧光与荧光光谱τ与发光速率常数Kf呈反比关系，即τ=1/Kf,Kf越大，则τ越小一般物质的τ为10-9s数量级，因而测量τ时所用的脉冲时间必须小于10-9s，在测量τ时只能用光脉冲，所用仪器为瞬态荧光光谱仪一般荧光光谱仪用氙灯产生荧光，发出的荧光是稳定的,因此普通所用的荧光光谱仪不能测量τ1.2FRET的理论基础两种不同的发荧光分子，一个为D，另一个为A。当D吸收激发光，使D处于激发态D*。这时如果在附近存在A，D*的激发能传给附近的A，使A处于激发态A*,A*就会发荧光(荧光）这一现象称为激发能量转移或荧光共振能量转移。D为供能者（donor,D),A为受能者（acceptor,A),A发出的荧光称敏化荧光。hvAADAD**FRET的理论基础Forster详细研究了上述现象，提出了共振转移理论两个分子的振动频率相同，可发生能量转移（就好像一个振动的音叉可引起附近另一具有相同频率的另一音叉振动一样），因此称共振能量转移FRET产生的条件（1）D、A都能发荧光；（2）D的发射光谱和A的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠；（3）D和A之间的距离必须小于10nm。FRET的理论基础根据Forster理论，D和A之间能量转移率KT可用下式表示(1)式中D为D的荧光寿命;n为介质折射常数;D为D的荧光量子产率；为取向因子，它和两个振子之间夹角有关，随机分布时2=2/3;J为光谱重叠积分，它与D的发射光谱及A的吸收（激发）光谱重叠程度有关；r为D与A之间的距离。由上式可见，J越大，r越小，则KT越大。从上式得知，只要测得D和A之间的能量转移率KT即可求得D、A之间的距离rJrnKDDT614225108.8FRET的理论基础设：KT=Kf=D-1时,D与A之间的距离为临界距离R0，则(2)（1）式除以（2）式，得或(3)D可以从实验求得，Ro可以从文献中查得,因而只要测得KT，即可求出D和A之间的距离rJRnKDDDf60142251108.8660rRKKfT601rRKDTFRET的理论基础在实际运用中，用能量转移效率E比能量转移率KT更方便，E定义为将(3)式带入，得Forster方程的一个重要特征是能量转移效率与分子间距离r-6相关；换言之，能量转移的效率随分子间距增大迅速下降TDTKKE160660RrREFRET的理论基础另一方面式中IDA、ID分别为受体存在或不存在时供体的荧光强度所以(4)由实验测得IDA、ID,及文献资料查得R0,通过(4)式便可计算r值DDAIIE1DDAIIE1606601RrRIIEDDAFRET的理论基础用荧光共振能量转移方法测量二基团之间的距离r，称光谱尺（Spectroscopicruler）在受体结构与功能研究中，FRET常用来研究受体-配体之间的距离配体-受体相互作用的平衡常数受体二聚化受体构象变化2.FRET在受体研究中的应用2.1测配基-受体结合的距离利用FRET方法,测量NK2受体与其七肽配基相互作用时的距离用荧光探剂NBD标记在受体的不同位置；用荧光探剂TMR标记配基；两探剂分别成为能量转移时的一对供体D与受体A;由于配体与受体的相互结合，标记在受体上的NBD被激发后发射的荧光共振转移给TMR;荧光光谱表现为激发NBD（ex=476nm），产生的NBD的荧光强度（em=540nm）部分被猝灭，而TMR的荧光强度（em=575nm）增强。测配基-受体结合的距离NBD与TMR之间的距离r可通过测定ID,IDA运用（4）式计算。6个不同位置标记NBD受体与配基相互作用后计算出六个不同的r；从结果可见，插入第V和第VI跨膜螺旋区域之间的距离小于2.5nm,其它都比2.5nm大；在NK2受体的七跨膜螺旋结构模型中，配体与其受体作用的位置最大可能是插入第V和第VI跨膜螺旋区域之间。2.2受体二聚化（dimerization）研究表明，受体的二聚化过程，是激动剂与受体相互作用时早期发生的事件，也是受体在信息传递过程中机理的一部分。FRET是个精确研究受体二聚化的方法。在应用FRET技术时，激动剂与受体必须都具有荧光性质。FRET技术的工具—绿色荧光蛋白1992年Prasher克隆了绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因，并通过基因工程，GFP与受体蛋白融合，使GFP定位于活细胞的某一受体蛋白上，而GFP的荧光性质保持不变近年来还得到了波长红移或兰移的突变体—红色荧光蛋白(Redfluorescentprotein，RFP)和兰色荧光蛋白(Bluefluorescentprotein，BFP)。同一细胞中可以同时表达两种荧光蛋白（如GFP、RFP）FRET技术的工具—绿色荧光蛋白在活细胞膜上的促性激素释放激素受体(GnRHR)，同时构建并表达GFP和RFP两种荧光蛋白，二者均嵌入到GnRHR的C末端，它们在膜上均以单体monomer形式存在,它们的荧光互不影响。由于GFP的发射谱与RFP的激发谱存在部分重叠，GFP为Donor,RFP为acceptor,如果二者距离10nm，则可能发生FRET，即GFP吸收的光能可转移到RFP，利用这一原理研究GnRHR的二聚化过程。FRET研究受体二聚化GFP和RFP共同表达并定位在GH3细胞膜上；在共聚焦显微镜下观察活细胞膜上GFP和RFP各自的荧光；加入激动剂处理，分别记录处理前后RFP与GFP荧光的比例FR/FG,图中最下的是绿色荧光蛋白的荧光强度随时间的变化曲线(FG),中间的是红色荧光蛋白的荧光强度随时间的变化曲线(FR),最上的是FR/FG比值随时间的变化曲线；刚加入时，FR/FG约为1，二者荧光强度几乎相同，随着时间的推移，比值增加，说明GFP的荧光逐渐移到RFP上。如果不加激动剂，只加缓冲液或者加受体的拮抗剂，则比值无变化。FG0.50.70.91.11.31.51.70510152025time[min]fluoresenceintensity[normalizedtotime0]FRFR/FG2.3配基与受体平衡结合常数的测定平衡结合常数Ka（equilibriumbindingconstant）测定的原理如下结合平衡常数Ka定义为（5）[R]、[L]、[RL]分别为游离受体、游离配基、受体-配基复合物的摩尔浓度k1、k2分别是结合速率常数、解离速率常数[R]+[L][RL]k1k2]][[][LRRLKa21//1kkKKda平衡结合常数Ka测定FRET实验时,常用配基滴定受体。假设r为滴定中某一点的结合百分数将（5）式分子分母除以[RT]，得移项，得(6)][][0RRLr][][0RRLr][][0RRLr][][RTRLr)1]([][][][][]/[]][[]/[][rLrRTRLRTLrRTRLRTRLKa)1(]/[rKLra][]][[][][00RLRRRLKa测定Ka的方法1用已知浓度的配基[L]滴定已知的浓度的受体[RT],二者必须符合FRET时的条件;可以用荧光探剂标记，使之成为FRET中的供体D，另一个为接受体A;在滴定过程中作结合饱和曲线,结合达到饱和时r=1，即结合过程中，激发D而A的荧光不断增强，结合达到饱和时，A的荧光不再变化;根据结合饱和曲线，可求得滴定过程中任意一点的结合百分数r值,并求出相应r的每一点的[L]，（[L]=[LT][RL]=[LT]-r[RT]）根据(6)式,以r/[L]为纵轴,r为横轴，作图得到一条直线，直线的斜率为-Ka。测定Ka的方法2将（6）式变为移项，得此即Scatchard方程。以[RL]/[L]为纵轴，以[RL]为横轴作图为一直线；直线的斜率为–Ka,与横轴的交点为[RT]。)][][1(][]/[][RTRLKLRTRLa][][][][RLKRTKLRLaa测定Ka举例MHC1是T细胞的组织相容复合物，当细胞有毒性的肽存在时，二者可以形成结合物，它们先结合在内质网上，然后转移到细胞膜上。MCH1是一个异二聚体（heterodimer），由H-2Kd重链（H）和2m（2microglnbulin）组成。在FRET实验中MCH1是荧光的供体D，配基是流感病毒核蛋白序列中的9肽，由147～155位氨基酸残基（TYQRCRALV）组成，它是荧光的接受体A,它用dansyl标记，用dNP21表示。测定Ka举例具体实验过程过量的MCH1(2m/H-2Kd)，用dNP21平衡滴定MCH1异二聚体中含多个色氨酸残基，激发它时，荧光会转移到dNP21分子上，使dNP21分子发荧光，图a为dNP21的荧光光谱从图a可见，随着dNP21增加，荧光强度不断升高;当dNP21滴加到一定浓度时，荧