第八章-印迹技术

第八章印迹杂交技术第一节核酸分子杂交第二节探针与标记第三节固相支持物与印迹第四节常用核酸印迹杂交技术第五节影响杂交的因素第六节蛋白质印迹法第七节生物芯片目的要求掌握基本概念（印迹杂交技术、探针等）核酸分子杂交基本原理，核酸探针应具有的条件，核酸探针的种类，DNA印迹杂交的主要步骤。熟悉常用印迹杂交技术和芯片技术印迹杂交技术•印迹技术(blotting)是指将样品（核酸或蛋白质）电泳分离并转移到固相载体上，然后在载体上利用特异性的反应来检测样品的一种方法。印迹技术(blotting)Southernblotting用于分析DNANorthernblotting用于分析RNAWesternblotting用于分析蛋白质Easternblotting用于分析蛋白质(双向电泳蛋白质印迹技术)核酸分子杂交基本原理复性变性•核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。（固相和液相杂交）探针(probe)杂交的一方是待测核酸序列，另一方是已知核酸序列，通常把已知的核酸序列称作探针（probe）。•探针(probe)，是指与待测的分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。•除了核酸探针外，探针利用抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用的原理与靶分子结合。核酸探针应具有的条件：•带有标记物；•单链；•高度特异性；•检测方法应简单，灵敏度；核酸探针的种类•基因组DNA探针•cDNA探针•RNA探针•寡核苷酸探针核酸探针标记物分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类1、放射性同位素应用广泛，以32P应用最普遍，放射自显影。优点：灵敏度高；缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。2、非放射性标记物生物素：一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上，和抗生物素蛋白（avidin）特异结合，抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等)。地高辛：一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。•常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随机引物法、PCR标记法、末端标记法等方法标记探针核酸探针的制备切口平移法反应成分：DnaseI，EcolipolI,dATP,dGTP,dTTP,32P-dCTP,待标记的DNA片段标记结果：两条链都均匀标记。5’3’5’3’双链DNA5’3’5’3’5’3’5’3’带切口的双链DNADnaseIMg2+EcolipolIα-32P-dNTP变性32P部分标记的单链DNA片段切口原始位置切口最终位置32P标记的DNADNA切口平移标记法随机寡核苷酸引物（randomprimer)：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用•E.coliDNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）随机引物法（randompriming)5’3’5’3’双链DNA3’5’单链DNA变性随机引物3’5’Klenow片段α-32P-dNTP3’5’变性32P标记的单链DNA探针DNA的随机引物标记法PCR标记法•在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。末端标记法•DNA末端末端标记法只是将DNA片段的一端（5’端或3’端）进行部分标记。由于标记活性不高，标记物掺入率低，一般极少用做核酸分子杂交探针标记。末端标记法探针的纯化•目的：除去游离的标记dNTP•方法：乙醇沉淀、凝胶过滤核酸印迹杂交技术原理和流程（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片技术过程DNA印迹杂交的主要步骤•待测DNA样品的制备、酶切•待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳•凝胶中DNA的变性：碱变性•印迹（转膜）：–硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜–毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法•预杂交（封闭）•探针的制备•固相膜上杂交（控制温度）•洗膜：除去游离的探针•杂交信号的检测印迹杂交过程⒈样品制备→⒉电泳分离→⒊印迹→⒋预杂交→⒌杂交→⒍洗膜→⒎分析固相支持物•电泳用的凝胶不能直接做支持物•将核酸分子结合于表面•有较好的机械强度•常用硝酸纤维膜和尼龙膜上行毛细管转移凝胶滤纸玻璃板重物（500g）支持物转移缓冲液滤纸NC膜或尼龙膜吸水纸（1）毛细管虹吸转移法几种转膜方法：（2）电转移①一般用尼龙膜作电转移的载体（NC膜不行）②单链DNA和RNA可进行转移，双链DNA先在原位进行碱变性，随后中和，再转移③特点：转移快，2-3小时即可；（3）真空转移使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷。电转移法真空转移法预杂交•固相膜可结合DNA，包括探针。•封闭固相膜上多余的结合位点。•常用非特异性的DNA或蛋白质。影响杂交的因素•杂交温度，•离子强度•DNA和探针浓度•杂交促进剂，聚乙二醇•杂交时间常用核酸杂交分类Southern印迹检测经凝胶电泳分开的DNA分子,需转印到膜上Northern印迹检测经凝胶电泳分开的RNA分子,需转移到膜上斑点杂交检测未经分离的,固定在膜上的DNA或RNA分子菌落杂交和噬斑杂交检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和噬菌体中释放的DNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子杂交方法适用范围一、DNA印迹法（Southernbloting）将电泳分离的待测DNA片段转移并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。用途：检测目的DNA的存在，基因突变DNA凝胶电泳变性使DNA单链转移到硝酸纤维素膜（NC）毛细管作用电转移真空吸引与探针进行杂交放射自显影显出杂交区带SouthernblottingSouthern印迹杂交法M1210×SSC转移缓冲液Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g12与探针同源杂交的基因DNA片段基因组DNADNA酶切片段内切酶NC或尼龙膜NC膜或尼龙膜放射自显影照片操作：与DNA印迹相似RNA经变性后再电泳，凝胶中加甲醛保持RNA单链。用途：检测mRNA、检测基因表达情况二、RNA印迹法（Northernbloting）Northern印迹杂交•是一项用于检测特异性RNA的技术。RNA凝胶电泳使DNA单链转移到硝酸纤维素膜（NC）毛细管作用电转移真空吸引与探针进行杂交放射自显影显出杂交区带NorthernBlotβ-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达(Northern杂交)三、斑点印迹操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品变性后点在干的NC上，与探针杂交。用途：检测DNA样品同源性、细胞内特定基因拷贝数；mRNA的相对含量。四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法操作：NC膜拓印培养的菌落原位裂解菌落，释放DNA预杂交杂交结果分析从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落或噬菌斑检测重组体克隆的菌落杂交技术菌落杂交菌落杂交概念：在细胞或组织切片中进行核酸杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu)用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位；研究细胞特定基因表达水平；确定组织有无病原体感染等。五、核酸原位杂交（组织原位杂交）原位杂交蛋白质印迹法•Western印迹法（Westernbloting）分析蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法•用途：鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。•典型的印迹过程包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹（Westernblotting)将待测蛋白质（抗原）变性电泳转移到NC膜上加入抗体加入标记的二体显示区带检测封闭检测分析应用举例•基因芯片与中医寒证的7类相关基因对典型寒证而且用热药有明显疗效者，尝试用基因芯片筛选出59条差异表达基因表达谱（涉及到7类基因），探索寒证所涉及的相关基因类别。•方法：精选对其治疗有明显疗效的典型寒证病例，在治疗前后分别采外周血，提取血液中的mRNA，再逆转录为cDNA以备检测。采用2035条人的靶基因cDNA制备成基因表达谱芯片。用两种荧光物质分别标记治疗前与治疗后cDNA，用其制备成探针与表达谱芯片进行杂交。结果：初步筛选出了差异表达基因59条，涉及到与能量代谢、糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、免疫和内分泌等7类基因。•与能量代谢相关的5条基因都为表达下调。•与糖代谢有关的2条基因也表现为下调。•与脂及酯类代谢相关的2条基因均下调。•与核酸代谢相关的基因10条以下调为主，上调为辅。生物芯片技术（biochips）传统核酸印迹杂交的缺点：•传统核酸印迹杂交：SouthernBlotting和NorthernBlotting等•技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(lowthrough-put)等生物芯片（biochips）——指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的特点：①高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子）②微型化（可装入口袋）③自动化（技术自动化；结果分析自动化）④低成本（相对于同时进行大量分子研究而言）生物芯片的分类：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白质芯片组织芯片细胞芯片微阵列芯片芯片实验室（Lab-on-a-chip）正处于研究阶段芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。基因芯片（Genechip）又称为DNA微阵列（DNAMicroarray）或DNA芯片（DNAchip）。将大量的基因探针分子固定于支持物上，然后与经过标记的样品DNA进行杂交，探针能够在基因混合物中识别出特定基因，最后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定基因进行分析。基因芯片用途表达谱芯片（最常用）指纹图谱芯片毒理芯片诊断芯片测序芯片Affymetrix基因芯片的实验流程2.基因芯片技术流程显微光蚀刻/压电打印/分子印章原位合成法探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA芯片微量点样法核酸提纯扩增与标记标记核酸纯化样品准备杂交与漂洗扫描与分析①基因芯片制备就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针，通过一定的方法固定到固相支持物上。主要有两种：原位合成法和直接点样法原位合成法和直接点样法的比较②样品制备——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。生物素常用标记物：荧光素待测样品（用Cy3-dUTP标记）对照样品（Cy5-dUTP）待测样品用Cy3，发射562nm红色荧光对照样品用Cy5，发射664nm绿色荧光以表达谱芯片为例：I.提取样本组织细胞中的mRNA（样本要新鲜并有代表性）II.对提取出的mRNA进行纯化III.逆转录合成cDNA（可进行PCR以提高灵敏度）IV.以双链cDNA为模板进行体外转录（荧光标记在此渗入）③分子杂交——是已标记的样品与芯片上的探针进行反应后产生一系列信息的过程。与传统的核酸分子杂交相同，但要求更高：选择合适的反应条件、减少生物分子之间的错配率。考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。利用生物素标记的，在此染色（常用抗生蛋白链菌素-藻蓝蛋白）④信号检测——利用专门的芯片扫描仪对杂交结果进行图象采集和分析。荧光标记阳性杂交图⑤数据分析——基因芯片读数实际上是扫描后的信号强度，是一种相对值。不同芯片之间要经过以看家基因作为对照的标准化处理才有可比性。——目前，主要有两种分析方法：常用GAPDH或β-actin基因基因聚类分析基因表达差