表面等离子共振-(SPR)-技术与Biacore原理

CompanyLOGO表面等离子共振(SPR)技术与Biacore原理戴璐表面等离子共振(SPR)原理表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。当以波动光学的角度来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝波。表面等离子共振(SPR)原理等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，这实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为等离子波。表面等离子共振(SPR)原理SPR光学原理：光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，使反射光完全消失的入射角就是SPR角。SPR角随金膜表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金膜表面结合的分子质量成正比。因此可以通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取分子之间相互作用的特异信号。SPR生物传感器SPR生物传感器的光源为偏振光(polarizedlight),传感芯片(sensorchip)表面镀有一层金膜,实验时,先将一种生物分子(ligand)固定在金膜表面,然后将与之相互作用的分子(analyte)溶于溶液(或混合液)流过芯片表面。SPR检测器能跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化,不同角度的反射光的光强被记录后得到角度-光强曲线图,每条曲线的波谷即为该曲线的共振角,共振角对应的角度为共振信号(resonancesignal),时间与对应共振信号的曲线即为SPR传感图(sensorgram)。SPR生物传感器以免疫学分析为例,在金膜表面固定某种受体(如抗体),然后流过含相应配体(如抗原)的样品,配体与受体的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而导致共振角发生变化。为了表述的方便,共振角(或共振信号)可以用共振单位(resonanceunits,RU)来表示。对大多数生物分子而言,1000RU大约等于1mm2的面积上有1ng的质量变化，相当于溶液中蛋白浓度为6mg/ml。SPR生物传感器通过检测获得共振角的改变程度,便可以对配体浓度进行定量。SPR生物传感技术的应用领域生物大分子的相互作用：肿瘤研究免疫学和传染病神经科学生物制药蛋白质组学Biacore可研究的生物分子范围蛋白质DNA/RNA脂类/脂质体/生物膜多糖多肽小分子全细胞/病毒/微生物可分析的对象Biacore核心组件Biacore提供的生物分子相互作用信息：有无结合(YesorNo)结合的特异性和选择性(Specificity)两种分子的结合强度--亲和力(Affinity)结合和解离的快慢和复合体的稳定性--动力学(Kinetics)功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序(Mechanism)分子结合的温度与热力学特征(Thermodynamics)目标分子活性含量的检测(Concentration)SPR光学组件微流控系统(IFC)集成化、自动化的微流路控制系统样品消耗量低为互相作用分析而设计优化微流控系统(IFC)–流动池IFC上有4个流动池可选择单独、配对、串联使用。流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2,Fc3-Fc4)传感芯片传感芯片葡聚糖表面亲水性温和型:和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相似非特异性结合量低高结合容量易于进行共价结合出色的化学稳定性传感芯片的选择11种不同的芯片种类CM5,CM4,CM3：芯片蛋白、肽段、小分子等CM7：小分子化合物研究SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等BiotinCAP芯片：可逆性生物素捕获芯片NTA芯片：His重组蛋白L1芯片：模拟脂质双分子层环境HPA芯片：实现膜系统相关的互作分析C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子Au裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）30余种不同的试剂盒及缓冲液产品：氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒；GST捕获试剂盒GST重组蛋白分析；NTA捕获试剂盒His重组蛋白分析；最常用的传感芯片：CM5传感芯片Biacore实验的基本流程分析物和配体的定义固定配体(Immobilization)：样品进样(Injection)分析物(Analyte)进样后，以恒定的流速和浓度流过芯片表面样品中的待分析物与固定在芯片表面上的配体发生结合，芯片表面物质的质量发生改变，仪器记录下对应的响应值(response)的改变进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面，分析物由配体上自发解离，解离的进程由响应值实时监控。芯片再生(Regeneration)将自发解离后仍然结合于配体的分析物彻底洗掉。配体的结合活性必须保留。传感图(TheSensorgram)实验设计选用CM5传感芯片→在金膜表面固定表达纯化后的D结构域蛋白→流过含抗体的样品→抗体与D结构域蛋白的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而导致共振角发生变化→检测蛋白与抗体的结合情况。CompanyLogo