中成药上市后再评价基础研究的若干问题（PDF76页）

中药新药临床前和上市后再评价药效学研究的若干问题药品临床价值评价的目的1.指导和规范临床合理用药,研究无止境要用新的科学技术通过评价的方式对一个药品的实况进行分析评价，使得该药在临床上得以准确的应用。2.发挥医学基础研究的桥梁作用，快速有效服务临床工作运用医药学的最新学术水平，从药效毒理，有效物质基础，质量控制等方面，有利于全面提升已上市的药品的科技含量，提供新的生物科技信息。中药研发和评价技术平台探索符合中医药特点的研究方法，构建现代新药发现和评价的技术体系–基于中医理论和临床特点的现代中药新药发现模式–基于重要整体作用特点和现代生物医学理论和技术的中药筛选方法研究–适合中药多成分和复杂作用特点的中药评价技术研究中药研制的特点和现状特点：•有中医医学理论指导及长期临床应用经验•临床优势与特色较突出问题：•立项依据不够充分•中药功效体现不足•临床前药效学研究结果支持力度不够•研究薄弱，多成分，作用靶点和机理研究尚不充分筛选A.优化处方B.筛选药效指标应针对主治针对临床适应症•脑缺血急性期用药----MCAO模型72小时内各项指标•脑缺血恢复期期用药（肢体功能障碍、中风后抑郁、血管性痴呆）----MCAO模型造模后3天至3个月内针对具体疾病的主要指标。•肝纤维化用药----肝纤维化组织形态学结果不妥善的药效指标举例•脑缺血急性期用药----抗氧化指标•肝纤维化用药----体外溶栓指标•流感用药----体外抗菌指标1.针对疾病模型进行有效性研究例：缺血性脑病研究方法关键问题：临床定位准确缺血性脑卒中病理机制缺血性脑卒中是一种严重威胁人类特别是中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、最完善的治疗手段，仍可有75％的存活者遗留有不同程度的残疾，是成人致残的首要原因。缺血性脑卒中病理机制复杂过程脑缺血：•能量耗竭，酸中毒•炎症级联反应•细胞凋亡•自由损伤•内源性保护机制：热休克蛋白、营养因子、内源性抗氧化剂等•兴奋性氨基酸毒性：一氧化氮毒性时间窗分期与病理改变赵建国主编.脑梗死.北京：人民卫生出版社，2006•超早期：1-6h，病理改变可逆。•急性期（坏死期）：6-48h，病变组织变软、坏死，神经细胞大片消失，脑损伤进行性加重。•恢复早期（软化期）：3-14d，病变组织变软液化，星型细胞增生，血管侧支循环重建及神经组织修复重塑启动。神经功能障碍明显。•恢复期：3-4w后，液化坏死组织清除，卒中囊、胶质瘢痕形成。•后遗症：可持续数月至1-2年，可出现由缺血性脑损伤引起的痴呆、抑郁。急性期评价指标（1）脑梗死范围（2）神经症状（3）脑血流量（CBF）或区域性脑血流量（ICBF）（4）脑组织含水量（5）脑内神经递质（6）脑组织生化指标：包括能量代谢和毒性产物，如三磷酸腺苷（ATPase）、磷酸肌酸（Per）、乳酸（LA）、乳酸脱氢酶（LDH）、自由脂肪酸（FFA）、脂质过氧化物（LPO）、兴奋性氨基酸（EAA）及基因表达等。（7）脑电图（EEG）：用于全脑缺血时，确定脑缺血的形成及再灌脑血流恢复正常的时间。（8）神经细胞病变程度：应进行定性、定量组织学观测。InfarctsizeofratswithtMCAO(TTCstaining)ShamVehicleShamVehicleNormal（1）急性期评价指标——TTC染色01342（2）急性期评价指标——神经症状评分用于恢复期评价指标——以梓醇为例ModelNBPCTPLCTPMCTPHSham行为学检测形态学检测分子生物学检测神经评分横木行走抓握力量步态分析组织特殊染色免疫组化染色超微结构Bcl-2和BaxNGF、BDNF、VEGF、bFGFPI3K和AktNGF和TrKA、BDNF和TrKB梓醇BC（1）恢复期评价指标——行为学实验（神经评分）0124300.20.40.60.811.21.41.61.83d7d10d14d神经评分（分）shammodelCTP15mg/kgCTP30mg/kgCTP60mg/kgNBP70mg/kgBC7mg/kg########********药物对脑缺血损伤大鼠不同时间点神经评分的影响*p0.05,**p0.01vsmodelgroup；##p0.01vsshamgroup*0123456783d7d10d14dshammodelCTP15mg/kgCTP30mg/kgCTP60mg/kgNBP70mg/kgBC7mg/kg########*********横木行走评分（分）药物对脑缺血损伤大鼠不同时间点横木行走能力的影响*p0.05,**p0.01vsmodelgroup；##p0.01vsshamgroup（1）恢复期评价指标——行为学实验（横木行走）02004006008001000120014003d7d10d14d抓握力量shammodelCTP15mg/kgCTP30mg/kgCTP60mg/kgNBP70mg/kgBC7mg/kg########********梓醇对脑缺血损伤大鼠不同时间点抓握力量的影响*p0.05,**p0.01vsmodelgroup；##p0.01vsshamgroup*（1）恢复期评价指标——行为学实验（抓握力量）（1）恢复期评价指标——行为学实验（触觉刺激实验）0501001502002503003504003d7d10d14dshammodelCTP15mg/kgCTP30mg/kgCTP60mg/kgNBP70mg/kgBC7mg/kg########********梓醇对脑缺血损伤大鼠不同时间点揭除胶布潜伏期的影响揭除胶布潜伏期（秒）*p0.05,**p0.01vsmodelgroup；##p0.01vsshamgroup研究方法二、步态行为SpinalCordInjuryPeripheralnerveinjuryTraumaticbraininjuryParkinson’sdiseaseCerebralischemicinjuryNeuropathicpainArthritisMotionmusculoskeletalinjuries脊髓损伤周围神经损伤脑外伤帕金森综合症脑缺血损伤神经性疼痛关节炎运动肌肉骨骼损伤研究方法与结果GAS-2检测实时步态行为研究方法与结果训练阶段1.视频采集分析计算机2.大/小鼠步行通道5.背景增强装置4.足迹增强板3.高速摄像机录像阶段分析录像疗效评价在脑缺血损伤恢复早期（3-14d），通过口服给药治疗，大鼠的运动感觉功能得到明显改善，与模型组比较，能够减轻神经功能行为学评分，提高横木行走能力和抓握力量，缩短揭除胶布潜伏期，步态行为有改善，说明药物能促进脑缺血损伤大鼠神经功能的恢复。研究内容防治血管性痴呆的药效学评价防治血管性痴呆的机理研究血管性痴呆药物评价指标（缺血后遗症期）（1）利用Morris水迷宫检测学习记忆功能的测定空间参考记忆工作记忆隐藏平台获得实验空间搜索实验工作记忆（1）测试大鼠空间参考记忆能力：①隐藏平台获得实验：测试大鼠寻找隐藏平台的逃避潜伏期及游泳路径。观察药物对空间参考学习、记忆获取能力的影响。②空间搜索实验:撤除平台，测试大鼠在原平台象限游泳时间、路程和大鼠在水池中穿过原平台所在位置的次数。观察药物对空间参考记忆保持能力的影响。（2）测试大鼠工作记忆能力：将平台的位置改为不固定,记录动物寻找移动平台的时间和路径。观察药物对工作记忆能力的影响。1.痴呆动物有明显的步态行为改变2.药物治疗可以逆转部分步态行为改变4.步态行为检测可以作为AD行为学的评价手段3.老年痴呆动物步态行为改变与认知功能降低有一定相关性步态分析结果（2）对血管性痴呆大鼠神经病理学的影响对MCAO血管性痴呆大鼠神经病理学改变的影响对慢性低灌注性血管性痴呆大鼠神经病理学改变的影响HE染色计数海马锥体细胞尼氏染色尼氏体变化海马GFAP表达星形胶质细胞活化及增殖胆碱能神经系统自由基代谢Glu/GABA学习记忆调节系统突触结构蛋白表达机理研究治疗血管性痴呆的机理研究三、注意中药特色特点的药效学设计加强证候模型的应用，突出方-证的适配性证候理论研究的基础上，引入先进的研究理念和技术，探究疾病发生发展的生物学本质，寻找证候产生的主要生物标志物，解决作用于复杂生命体的具有复杂化学体系的方、药的干预实质，发挥方、药的临床作用病证结合模型示例1：Ⅱ型胶原注射结合寒湿/湿热刺激致类风湿性关节炎大鼠病证结合模型观察指标:•疾病观察指标：肿胀度、踝关节组织病理学、IgG、C反应蛋白、炎性细胞因子等•证候观察指标：一般状态（活动度、皮毛、舌色、口唇颜色、心率等）、体温、饮水量、摄食量、体重、cAMP/cGMP、血流变、神经递质等•具差异性的指标：DA、IFN-y、PDGF-AA、CINC-2a、IL-1•寒湿刺激法复制寒湿型RA大鼠模型：将注射CⅡ大鼠置于动物实验箱中，设定温度5℃，湿度95%，模拟寒湿病因。每天刺激8h，连续6周。•湿热刺激法复制湿热型RA大鼠模型：将注射CⅡ大鼠置于动物实验箱中，设定温度35℃，湿度95%，模拟湿热病因。每天刺激8h，连续6周。模型建立方法：病证结合模型示例2：证侯人血清药理学研究方剂的功效是特定方药与特定病证之间相互作用的结果体外证侯病人(血清)方药(含药血清)---干预刺激RAW264.7细胞检测Toll样受体（1-9）细胞因子1.不是中枢兴奋与镇静2.终点指标:脑功能的改善促清醒(脑电图)------模型:感染中毒性脑损伤缺血或出血性脑损伤等3.主要作用环节:突触结构、神经细胞保护、神经发生和血管新生一与“开窍醒神”功效相关的生物学指标突触结构神经细胞保护机理研究血管新生神经发生意识障碍及昏迷EEG慢化（β↓δ↑）胆碱递质系统紊乱Ach单胺递质系统紊乱NE,5-HT,DA脑损伤(皮层及脑干)EEG激活（β↑δ↓）神经元和突触结构及形态神经元和突触结构及形态安宫牛黄丸安宫牛黄丸意识及行为觉醒与“开窍醒神”功效相关的生物学指标(安宫牛黄丸)观察指标对脑损伤大鼠脑电图的影响1对脑损伤大鼠皮层锥体细胞及突触超微结构的影响2对脑损伤大鼠脑血管生成和神经发生的影响3对脑损伤皮层及脑干胆碱神经递质系统的影响对脑损伤皮层及脑干单胺类神经递质系统的影响对中枢神经递质作用的共同环节的影响对脑损伤大鼠脑电图的影响1Fig1TracingofelectrocorticograminratsEEGofanaesthesiaratsEEGofwakingratsFig2NormalelectrocorticogramofawakingratsFig3Electrocorticogramoffocalcerebralischemiarats34567891h2h4h6hpowerofδ(μV2)ControlModel05101520251h2h4h6hpowerofβ(μV2)ControlModel***212325272931333537391h2h4h6hrelativepowerofβ（%）ControlModel*681012141618201h2h4h6hrelativepowerofδ（%）ControlModel***Fig4InfluenceofLPSondelta-andbeta-waveofEEGinawakerats对脑损伤大鼠皮层锥体细胞及突触超微结构的影响2SynapticinterfaceMeasurementofsynapseindexesO：BullulesbeforepresynapticmembraPD：Post-synapticdensity；L：Lengthofsynapseactivezone结果1缺血性及内毒素性脑损伤可引起脑电图β波功率及相对功率降低，δ波相对功率提高。LPS可引起皮层锥体细胞胞体缩小，核固缩，多数细胞核仁消失；导致突触数量的减少，突触超微结构破坏，突触间隙缩窄，突触前膜囊泡大量聚集，突触后膜PSD减少。2全方可以使β波功率和相对功率增加，表现脑电激活作用，