生物体内抗重金属离子的蛋白质的研究状况

-1-生物体内抗重金属离子的蛋白质的研究状况（×××××××××）摘要：本文主要对抗重金属离子的蛋白质研究进展进行了综述,通过对离交换蛋白家族(CAX)、金属结合蛋白家族(MT)、助阳离子扩散蛋白家族(CDF)、ZIP蛋白家族、ATP结合蛋白家族(ABC)以及细胞壁相关激酶蛋白家族(WAK)等蛋白质的结构、功能及作用机理的研究，使借助于转基因技术将耐重金属蛋白基因转移到一些某些特定的生物体上，并培养出能高效去除环境中重金属离子的生物，为生态环境中重金属污染土壤的修复提供理想的材料。关键词：抗重金属离子；蛋白家；研究状况AdvancesinProteinFamiliesofbiologyforToleranceofHeavyMetalsAbstract:Theadvancesinproteinfamiliesfortoleranceofheavymetalsarereviewedinthispaper,includingcalciumexchanger(CAX)family,metallothioneins(MTs)family，cationdiffusionfacilitator(CDF)family,ATP-bindingcassette(ABC)family,wall-associatedkinase(WAK)familyandetc.Thestructures,functionsandmechanismsofthoseproteinsarediscussedsimply,whichcanmadebytransgenictechnologytransferproteingeneinheavymetaldetoxificationandtolerancetosomecertainorganisms,andcultivateefficientremovalofheavymetalionsintheenvironment,ecologicalenvironmentforheavymetalcontaminatedsoilrepairtoprovideidealmaterials。Keywords:Heavymetal；Proteinfamily；Mechanism随着工业的发展，人类面对的的环境问题越来越严重，尤以重金属污染为重。高浓度的重金属环境的毒害不仅在不能被普通生物分解，而且还会经食物链进入人体引起众多疾病。重金属污染胁迫最显著的效应就是消除敏感种或个体，改变生物群落物种构成。因此，减轻污染，刻不容缓。近年来，随着分子生物学的发展，使借助于转基因技术将耐重金属蛋白基因转移到一些生物量大、生长快的植物或微生物上，培养出能高效去除环境中重金属离子的品种，为生态环境中重金属污染土壤的修复提供理想的材料成为可能！而这些具有重金属抗性的植物或微生物是通过延迟重金属跨膜吸收[1]，使其有足够长的时间来启动细胞内耐重金属机制；将重-2-金属离子富集在液泡、细胞壁及内质网等部位[5][14][15][26]。在这些生理过程中，金属结合蛋白和金属转运蛋白都发挥了重要作用。下面将对这些抗重金属蛋白家的研究进展作进一步的综述。1.CAX离子交换蛋白家族离子交换蛋白(calciumexchanger，CAX)是位于液泡膜上的反向转运蛋白。CAX已在细菌、粘菌、真菌类、植物和低等脊椎动物中发现，主要分3类：I型分布在植物、真菌类和细菌中；II型具有N端亲水域，存在于真菌类、粘菌和低等脊椎动物中；III型仅分布于细菌中[2]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中CAX1、CAX2均可将Ca2+转运入液泡，两者的开放阅读框有43%同一性、56%的相似性。实验证实CAX2是一个反向转运蛋白，包含11个跨膜结构域，分子量约为39kD，有3个氨基酸结构域，具有Mn2+特异性，改变这些结构域CAX2将丧失Mn2+转运能力。烟草(Nicotianatabacum)CAX2的表达可使植株富集更多的Ca2+、Cd2+和Mn2+，尤其对Mn2+有更高的耐性，同时可增加Cd2+、Mn2+在离体根液泡膜微囊中的转运[3][4]。植物、酵母和细菌的CAX均可利用H+梯度的变化而改变Ca2+和其它金属离子的细胞定位[5]。有研究证实:从水稻(Oryzasativa)中鉴别出CAX，通过即时PCR检测mRNA在不同器官中的表达，发现水稻CAX1a几乎在所有器官中都有表达，CAX1b和CAX1c在很少的器官中表达，且表达水平很低，CAX2和CAX3的表达随器官不同而有变化。在酵母中，水稻CAX1和CAX3的表达提高了其对Mn2+的耐性[6]。2.金属结合蛋白家族金属结合蛋白(肽)是普遍存在于多种微生物、动物和植物细胞内的对金属离子具有亲和能力的蛋白质（肽），它们可与环境中的金属离子通过化学结合作用形成复合物而降低、富集或消除金属离子对生物细胞的毒性。金属结合蛋白(肽)最重要的结构特征是其富含His、Cys等氨基酸，如锌指结构蛋白、金属硫蛋白MTs(metallothioneins)等[7]。其中，根据半胱氨酸的含量和结构，MT可分为三类:classⅠMT、classⅡMT和classⅢMT[8]。哺乳动物的MT属于classⅠMT，有61个氨基酸，其中20个是半胱氨酸残基。它们含有结合7个二价金属离子或者12个单价金属离子的两个不同的结构域。酵母、蓝细菌和一些高等植物中发现的MT是classⅡMT，它们的半胱氨酸与classⅠMT的分布不同。植物细胞对重金属抗性的主要作用机制是螯合作用，即通过金属结合肽的诱导和金属络合物的形-3-成，植物络合素(phytochelatins，PCs)是classⅢMT的成员，在植物重金属络合物的形成中起重要作用。PC一般由谷胱甘肽经酶促合成，它的生物合成受许多金属如Cd、Hg、Ag、Cu、Ni、Au、Pb、Zn的诱导，其中Cd是最强的诱导剂[9]。实验发现：CdCl2胁迫3天后，PCs在转基因拟南芥中的表达比野生型植物增加了1.3-2.1倍，植物对Cd2+的富集显著提高[10]。3.CDF蛋白质家族助阳离子扩散蛋白(cationdiffusionfacilitator，CDF)家族具有耐重金属作用，存在于很多种生物体液泡膜上。非直接的证据显示:这些蛋白质具有运输作用，既可以将金属离子运输入细胞内，也可以将金属离子输出细胞。并且CDF蛋白质有助于多数生物体对Zn2+、Cd2+、Co2+、Ni2+的耐受性。CDF蛋白作为一类与膜结合的蛋白在很多生物体中有发现，随着研究的不断深入，研究者发现此家族蛋白都表现出一些共同的特征：①包括6个预测的跨膜区(TM)；②N一端有一段特征信号序列；③含有一个C端的离子排出功能域(CEdomain，pfam05145)；④真核生物成员的第四、第五个跨膜区之间通常有一段比较大的、富含组氨酸的胞质序列。在拟南芥中有8个基因编码的蛋白质属于CDF家族，4种具有上述结构特征，而其他几种(AMTPc1-AtMTPc4)的结构略有不同：包含4-5个跨膜结构域，其中3种只具有部分N-端信号序列，并缺乏His富集域。拟南芥AMTP1的主要功能是提高细胞的金属耐性[11]。研究显示：AMTP1可以对Zn2+的毒害起解毒作用。如果在光滑爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞中表达AMTP1，则可富集更多的Zn2+。此外，通过将有钩柱花草(Stylosantheshamata)cDNA文库在啤酒酵母中的表达，鉴定出4种相关的CDF蛋白，其中ShMTP1对Mn2+有耐性。而Persuns等人从野生芥末(Thlaspigoesingense)中分离出TgMTPs基因，它编码的CDF蛋白可以恢复啤酒酵母COT1和ZRC1(酵母中对Zn2+和Co2+有耐性的CDF蛋白)突变体耐重金属的能力[12]。4.ZIP蛋白质家族ZIP(zinctrans—porter)蛋白家族和CDF家族有很多相似之处，两者共同组成植物中重要的、普遍存在的两类转运家族，其在植株吸收、存储金属方面发挥着重要的作用。其中，ZIP家族在对金属如Zn2+的吸收中起作用，而CDF蛋白主要参与液泡鳌合及从胞质转出金属离子等。-4-ZIP和CDF蛋白结构特征ZIP和CDF蛋白作为比较普遍的转运系统，在结构上存在一些区别，如图。ZIP和CDF(ZnT)成员其预测结构为：A.ZIP推测有8个跨膜结构域(除了LIV一1亚家族为7个TM)，在III和IV跨膜区之间的胞质区有一段富含组氨酸的可变区，ZIP蛋白将ZnZ+从细胞外或者胞内各区室转运至细胞质；B.CDF(ZnT)成员被推测有6个TMD，与ZIP蛋白类似，富含组氨酸的环存在于胞质，CDF(ZNT)蛋白将Zn2+等从胞质转运至胞外空间或胞内各区室，在两类家族中，富含组氨酸的结构域结合锌离子等，而跨膜结构域则形成离子通道。5.ABC蛋白家族ABC(ATP-bindingcassette)蛋白家族是细胞周质转运蛋白，起维持离子平衡的作用[15]。实验发现：真菌的ABC转运蛋白在药物耐性和解毒方面起一定作用[16]，一些拟南芥ABC转运蛋白在植物生长方面参与了解毒作用[17]。在拟南芥中，已知有3个线粒体ABC转运蛋白(ABCtransporterofthemitochondria，ATM)，AtATM1和AtATM2位于第4染色体，AtATM3在第5染色体上。在拟南芥中，AtATM3可以增加植物幼嫩部位Cd2+的富集，从而增加整株植物对Cd2+的耐性[18]。并且AtATM3可调节谷胱甘肽的生物合成，推测谷胱甘肽-铬联合体在线粒体中加工形成后被AtATM3转运出去。6.WAK蛋白家族细胞壁连接的类受体激酶(WAK)是一类特殊的植物类受体激酶，与细胞壁中的果胶共价交联。在结构上，WAK分为胞外域、跨膜域和胞内激酶结构域，胞外域中存在保守的EGF重复序列。WAK以多基因家族形成存在，其表达模式具有组织特异性，主要在叶、茎中表达，在功能上参与病原菌反应、细胞伸长调控、铝胁迫反应等。WAK1在细胞外与富含甘氨酸的蛋白质AtGRP3特异结合，在胞内与蛋白磷酸酶KAPP结合并形成约500kD的AtGRP3-WAK1-KAPP复合体[19]。-5-拟南芥WAK是一个含5名成员的基因家族，分别为WAK1-5，位于拟南芥1号染色体上一个约30kb的区域。5名成员呈串连分布，依次为WAK4，WAK5，WAK3，WAK1和WAK2，并且转录方向相同[20]，均含有约20个氨基酸的信号肽(N端)、EGF重复序列、跨膜域和位于细胞内的激酶域，在EGF样区域和跨膜域中含有两个插入位置和插入长度保守的内含子，长度分别是80和76碱基。WAK可能参与金属离子的胁迫和耐受反应。Sivaguru等人[21]报道，铝可以诱导拟南芥WAK1的表达，铝处理3h根中WAK1的mRNA水平达到最高随后下降，蛋白表达高峰则出现在铝处理6h，所以认为WAK1是受铝诱导的一个早期反应基因。将WAK1转入拟南芥超表达后，由于铝胁迫引起的根生长抑制被明显减弱了，说明WAK1的增加有助于植物对铝的耐受性。他们还发现，铝可以诱导气孔关闭，应用免疫荧光技术观察到铝处理6h后，根伸长区和分生区细胞的WAK表达明显增加，且铝处理9h导致微管解聚[21]，但WAK的表达与微管解聚是否有关还不清楚。Decreux等人[22]的进一步研究发现，WAK1与果胶的结合需要细胞壁中存在适当浓度的钙离子，且在钙离子间形成所谓“钙桥(calciumbridge)”。7.其他蛋白质ECA1(endoplasmicreticulum-typeCa-ATPase)是拟南芥中4个内质网型Ca-ATPase亚族成员之一。生化和遗传学证据表明:ECA1的功能类似Mn2+泵，可以减少Mn2+对植物的毒害。有证据显示ECA1也可以运输Ca2+和Zn2+[23][24]。在高Mn2+条件下，拟南芥ECA1突变体的根绒毛和顶端生长均受到抑制。将拟南芥的ECA1基因在啤酒酵母(Saccharomycesce