Illumina测序基础知识

1第一个要给大家讲的，是它这个flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流动池”。我们来看这个图片。图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面，是做了8条通道。在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用2种DNA引物，把它（2种DNA引物）种在玻璃表面。这两种（DNA引物的）序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。这就是Flowcell。文库制作再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。第2个特点，它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。然后，再用连接酶把这个接头给连上去。连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。桥式PCR做好了Library之后，就要做桥式PCR了。桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。2杂交完了之后，我们在这里面加入dNP和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。新的这条链，和原来的序列是完全互补的。接下来，我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解链了。而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的链，就被保留下来。然后，我们再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液，在加入中和液之后，整个环境变成中性了。这时侯，DNA链上的另外一端，就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。接下来，我们加入酶和dNTP，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后，我们再加碱，把2条链解链解开；然后，我们再加中和液，这时侯，DNA链会和新的引物杂交。再加酶，再加dNTP，又从新引物合成出新的链来。连续重复这一过程，DNA链的数量，就会以指数方式增长。制备单链在桥式PCR完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测序的单链。办法是通过一个化学反应，把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。然后，再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯，碱让DNA的双链解链，那根被切断了根的DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在（芯片）上面的链。接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。正式测序好，接下来正式的测序工作就开始了。那么，在测序的时侯，加入进去的，最主要是2个东西：一个是带荧光标记的dNTP。而这个dNTP，它还有一个特点，它的3’末端是被一个叠氮基堵住的。然后，再加一个聚合酶，聚合酶就会选择：哪一个dNTP是和原来位置上的那个碱基是互补的，根据互补性原理，把这个dNTP合成到新的这个DNA链上去。3因为这个dNTP的3’端是被一个叠氮基团堵住了，所以，它一个循环只能延长一个碱基。然后，它就停在那儿了。合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶给冲掉。冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描。根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。因为4种dNTP，它每一种dNTP上面标的荧光素都不一样，根据红、黄、蓝、绿，它出来的哪种颜色，那么，就可以倒过来推出来，这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。因为新合成的碱基，是和原来位置（的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个。这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了之后，3’端的羟基就暴露出来。再接下来，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后，把多余的酶和dNTP冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下这个碱基是什么。不断重复这个过程，可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基，甚至更多碱基的序列读出来。读Index那么，什么是Index哪？是因为Illumina的评委会个测序量很大，往往一个样本，用不了那么几亿条DNA。所以，科学家就想了一个办法。在文库的接头上做了一些标记，每一个样本，它有一个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。这段特定的序列，我们就称为Index。也有人把它叫做Barcode，反正，表达的是一个意思：这么一段特定的序列，标记了样本的来源。那么，要读这个Index的序列，先用碱把上面这根测完“Read1”的序列，把上面这根DNA链给解链掉。4解链掉之后，再加入中性液，然后，加入“Read2”这个测序引物。Read2测序引物结合的位点，正好，就在这个Index序列的旁边。接下来，就进行第2轮测序，一般来说，是读6到8个碱基。把这6到8个碱基读下来，我们就可以知道，这某一个具体的一段DNA，它来自于原始的哪个样本。双端测序这是Illumina的最核心的另外一个技术，就是双端测序。那么双端测序，就是说，一根DNA链，除了从正向读一遍，还可以从DNA的负向，再读一遍。这一下子就把Illumina测序的有效长度加了一倍。这是非常有实际用途的。那么这个倒链的过程，是这样，先让这个DNA先合成，合成出来这根互补链。有了这个互补链之后，用一个化学试剂，在原来这根链的根上切一下。切一下，原来这根模板链就掉了，剩下那根互补链。再接下来，就进行第2端的测序。第2端的测序原理，和第一端的测序原理是一样的。加上了“Read3”的这个引物，依次往下，一个一个碱基地往下读。大规模平行测序那么最重要的事情是什么呢？一个点，经过几百个循环，就读出了几百个碱基。但实际上，这个芯片上可以有上亿个点，上亿个“cluster”，也就是“簇”。那么上亿个“cluster”，每个循环，它都可以读出地么多序列，这是Illumina测序非常强大的原因。因为是成千上万，准确说是上亿上链都在合成，这个就得到了很大的一个测序数据量。5IlluminaHiSeq测序仪的工作原理。也就是芯片上发生了这么多变化，HiSeq是如何把这些信息给读出来，并且把扫描出来的荧光信号，又通过怎样一系列的加工，变成可以识别的“A、C、G、T”的碱基序列的。HiSeq首先是一台高精度的显微光学扫描仪。然后再配上了一整套的液流系统，和计算机软硬件，再加温控系统，组成这样一台测序仪。其中最核心，也是结构最复杂的，是它的光学系统。前一期，我们讲了，Illumina测序仪主要是靠4种dNTP分别带有不同的荧光基团，在被激光照了之后，发出不同颜色的荧光。再通过对光的颜色的分辩，可以判断出到底是哪个碱基。光路结构这里，我们要说明一下：感光元件CCD，它本身是色盲。所以，它一定要配合滤光片，才能分辩出颜色来。那我们先来看一下，HiSeq的光路图。左边这两个元器件，就是激光器。一个发出红色激光，另一个发出绿色激光。其中红色激光主要是激发A和C，这两种碱基上的荧光基团；而绿色激光主要是激发G和T，这两种碱基上的荧光基团。红色和绿色这两束光，通过一面半透半反镜，组成一道激光。这道激光打在Flowcell上。那么请注意，Flowcell就放在这个位置。在Flowcell里面，结合在DNA上的那个荧光基团在激光的照射下，就发出荧光。6荧光通过3面半透半反镜，和1面全反镜，被分成4条光路，这4道光线，分别通过一道滤光片，这4张滤光片的滤过波长不一样。这样，这4道光在经过了滤光片之后，就变成了4种颜色不同的光线。然后，这4条颜色不同的光线，各自照在一面反射镜上，通过反射镜进入到CCD。这4个CCD就记录到不同颜色的光线。TDI线扫描HiSeq的光线扫描是“线扫描”，和传统的相机不一样，传统的相机是面扫描。HiSeq采取了一种特定的叫“TDI”线扫描方式，TDI是Timedelayintegration的缩写。在HiSeq上之所以采取TDI扫描方式，因为它有非常明显的优点。第一个优点，就是它的扫描速度非常快，在HiSeq2500上，从Flowcell的一个Lane的一头扫到另外一头，也就是一个“Swath”的扫描时间，大概只有20秒种不到。第二个好处，就是它的扫描精度非常高。在最新的HiSeqV4版试剂上，它的光点密度，大概可以达到每平方毫米90万个点，要扫描清楚这么高密度的光点，扫描仪的扫描精度是可想而知的。TDI扫描的第三个好处，是这种方式，可以把Flowcell的上表面、和下表面都扫描到。Flowcell（测序芯片）接下来，我们再要详细介绍这张Flowcell。7那么，先来看一下，这张flowcell有点象一张载玻片，在这一张片子里面，我们可以看到，它做了8条通道。每条通道，我们称为一个Lane。这8个Lane之间，相互是隔绝的。每个Lane的两端各有一个小孔。这两个小也孔，就是液流流进、流出的地方。每个Lane的上表面和下表面，都分别以共价键的方式，种了2种DNA引物。这两种DNA引物，是与文库接头的两头序列相互补的。上一期（节目）我们已经说明了这一点。一个Lane里面，分成2个面，上表面、和下表面。上表面和下表面，都种了DNA引物，也都是可以产生测序数据的。在每一条Lane的每一个面，又被分成了3个扫描通道，每个道被称为一个“swath”。每条Swath是从头到底被连续扫描的。但是它的数据，在进行数据分析的时侯，是被分割成16个小方块。这每一个小方块，被称为一个“tile”。这样一张Flowcell，总共就是768个Tile。每个Tile在扫描的时侯，会根据4种颜色，产生4张照片。图像处理扫描完了之后，就要进行图像处理。扫描出来的最原始的文件，它的格式是“.tiff”文件。Tiff文件记录了每个像素点上采集到的光强度。Tiff文件的优点是它是完全无损，保留了所有的原始信息。但它也有它的不足之处。它的不足之处就是它的这个文件太大了。它的数据量很大，既不便于数据的传输，也不便于数据的存储。8接下来，计算机软件就把图像文件转化成光点文件。光点文件叫“.BCL”文件。也就是“Basecalling”的英文缩写。要把图像文件，转化成BCL文件，就是把4种颜色的4张照片，组合在一起，变成一张有4种颜色的彩色照片。这其中首先要解决的，是4张照片在空间位置上的匹配问题，因为4张照片是通过4个CCD分别拍下来的，所以，会有一定的空间上的偏差。软件要通过对4张照片上，亮点相互比对，找到最合适的、匹配的位置。这里，我们要说明一下，如果被测的文库是碱基不平衡的文库，在这个空间匹配上就会遇到问题。什么叫碱基平衡呢？也就是说，在测序过程当中，每个循环，A、C、G、T四种碱基，都是比较均匀在存在的。最典型是人全基因组文库，这是一个典型的碱基平衡文库。那什么是碱基不平衡文库呢？最典型的，就是PCR扩增子产生的文库。PCR扩增子的特点：PCR是有特定的起始位点的，一个特定的测序循环中，几乎所有的片段都是同一种碱基，而剩下的3种碱基，就特别少。这在反映到照片上去的时侯，就变成：一张照片特别亮，光点很多。而其它的三张照片就特别暗，上面的光点就很少。这时侯，要软件做空间上的比对，软件就会觉得困难，因为对于那几张暗的照片，软件很难判断上面的光点，是否与那张亮的照片上的光点真正对得上。结果，就是判断出来的可靠性变差。最后，就是测序的数据质量变差，有效数据量也会变少。要解决这个问题，办法是在测序过程中掺入一些碱基平衡的文库。例如掺人全基因组文库。或者也可以掺Illumina提供的标准的PhiX文库，这些都是碱基平衡文库。它的作用，是在每个循环当中，为每一种颜色的照片，都提供足够多的亮点。这样，它可以弥补那些不平衡的文库当中缺亮点的问题。9BCL文件当把4种颜色的光点