生物分析化学课件

第四章生物分析化学4.1慨述4.1.1任务与作用以分析化学理论、技术和方法为基础以生物化学和分子生物学理论技术为补充以数学、物理学和计算机技术为手段第1页测量并获取生物/化学信息的前沿性交叉学科。三个主要任务：作为化学生物学的核心内容之一，它通过各种各样的方法和手段得到分析数据，获取各种物质的组成、结构和功能等方面的信息，从而为化学生物学的深入研究创造条件。第2页1、提供生物活性物质的组成、含量、结构、形态等方面的信息；2、发展获取上述信息的方法以及复杂生物物质的分离和纯化技术；3、创制用于研究生命活性物质间相互作用的技术手段。生物分析化学的独特内涵第3页1、研究对象是生命活性物质，既包括核酸、蛋白质等大分子，又含有种类繁多的活性小分子和调控分子；2、研究手段独特，生命体内的活性物质结构复杂、化学性质相似、生物活性各异，并且在生理条件下相互关联，对它们的分析测试要求是非破坏性的原位、活体分析；第4页3、细胞是生物体的基本单元，生命活性物质在细胞内存在并随时空和外界刺激而运动和变化，因此生物分析化学研究微环境和时空中的多维信息，更重要的是通过生物体内物质的相对简单化学成分，但组合与排序构筑了复杂多变的特殊形态和多级结构，它在服从化学基本作用规律的基础上更多地体现生物方面的规律；4、生命过程研究需要同时获取大量各类分子相互作用的生化信息，因此，高速、高通量分析方法显得尤为重要。4.1.2分类物质种类繁多，研究内容极其丰富；可按分析方法和功能分类；分析方法：化学分析、仪器分析；功能分类：分离分析、结构分析和定量分析第5页1.分离分析是指将复杂的生物体内物质分离成2.单一组分或组组分的一类方法，它主要包括电3.泳（毛细管电泳、二维凝胶电泳和微控芯片电4.泳等）、色谱技术等。5.特点是综合多种技术手段将分离与分析有机6.地结合在一起，提高工作效率。第6页2.结构分析：生物物质结构复杂，且结构决定其特有的性质和功能。研究生物物质结构和构象的方法很多，总体上分为两大类：一类是测定溶液状态下的分子构象，如核磁共振、圆二色谱、激光拉曼光谱、荧光光谱、紫外光谱等波谱分析法；另一类是测定分子的晶体结构，如x-射线衍射分析法和小角中子衍射法。第7页3.定量分析：生物分析化学研究的基本任务是确定生物物质的含量。其特点：物质含量极低富集、分离测定方法灵敏度高、准确、快速、简便、专一性第8页4.4生物活性小分子分析生物活性小分子是具有维持机体正常功能、调节生命活动过程的化学物质的总称；内源性外源性细胞分泌信号物质传递细胞内/间的信息调节自身及其他细胞的代谢和功能调节物质代谢和维持生理功能第9页类别物质基本功能生长因子类介质胰岛素、表皮、血小板类生长因子传递细胞间信息局部化学介质NO、CO传递细胞间信息神经递质乙酰胆碱、多巴胺传递细胞间信息激素蛋白质、肽、类固醇传递细胞间信息第二信使Ca2+、cAMP、cGMP传递细胞内调控信号维生素维生素、生物素、叶酸、泛酸调节物质代谢和维持生理功能微量元素铁、碘、铜调节物质代谢和维持生理功能部分生物活性小分子及功能第10页4.4.1一氧化氮分析一氧化氮是机体内一种作用独特的信号分子，在不同的器官、不同生理或病理状态下均存在着利与弊的双重影响。目前，检测NO的方法有光化学（紫外可见分光光度法、荧光法、化学发光）、电化学法、电子自旋共振法和生物检测法。第11页近来发现一氧化氮（nitricoxide，NO）广泛分布于生物体内各组织中，特别是神经组织中。它是一种新型生物信使分子，1992年被美国Science杂志评选为明星分子。NO是一种极不稳定的生物自由基，分子小，结构简单，常温下为气体，微溶于水，具有脂溶性，可快速透过生物膜扩散，生物半衰期只有3－5s，其生成依赖于一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthase,NOS）并在心、脑血管调节、神经、免疫调节等方面有着十分重要的生物学作用。（1）在心血管系统中NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用。在生理状态下，当血管受到血流冲击、灌注压突然升高时，NO作为平衡使者维持其器官血流量相对稳定，使血管具有自身调节作用。能够降低全身平均动脉血压，控制全身各种血管床的静息张力，增加局部血流，是血压的主要调节因子。NO在心血管系统中发挥作用的可能机制是通过提高细胞中鸟苷酸环化酶（guanylatecyclase,GC）的活性，促进磷酸鸟苷环化产生环一磷酸鸟苷（guanosine3′,5′–cyclicmonophosphatecGMP），使细胞内cGMP水平增高，继而激活依赖cGMP的蛋白激酶对心肌肌钙蛋白Ⅰ的磷酸化作用加强，肌钙蛋白c对Ca2+的亲合性下降，肌细胞膜上K+通道活性也下降，从而导致血管舒张。NO的生物学作用（2）在免疫系统中研究结果表明，NO可以产生于人体内多种细胞。如当体内内毒素或T细胞激活巨噬细胞和多形核白细胞时，能产生大量的诱导型NOS和超氧化物阴离子自由基，从而合成大量的NO和H2O2，这在杀伤入侵的细菌、真菌等微生物和肿瘤细胞、有机异物及在炎症损伤方面起着十分重要的作用。目前认为，经激活的巨噬细胞释放的NO可以通过抑制靶细胞线粒体中三羧酸循环、电子传递和细胞DNA合成等途径，发挥杀伤靶细胞的效应。免疫反应所产生的NO对邻近组织和能够产生NOS的细胞也有毒性作用。某些与免疫系统有关的局部或系统组织损伤，血管和淋巴管的异常扩张及通透性等，可能都与NO在局部的含量有着密切的关系。连续刺激小脑的上行纤维和平行纤维可引起平行纤维细胞的神经传导产生长时程抑制(Long-termdepression,LTD)，被认为是小脑运动学习体系中的一种机制，NO参与了该机制。（3）在神经系统中有关L-Arg→NO途径在中枢神经系统(CNS)方面的研究认为，NO通过扩散，作用于相邻的周围神经元如突出前神经末梢和星状胶质细胞，再激活GC从而提高水平cGMP水平而产生生理效应。如NO可诱导与学习、记忆有关的长时程增强效应（Long-termpotentiation,LTP），并在其LTP中起逆信使作用。在外周神经系统也存在L-Arg→NO途径。NO被认为是非胆碱能、非肾上腺素能神经的递质或介质，参与痛觉传入与感觉传递过程。现已证明在人体内广泛存在着以NO为递质的神经系统，它与肾上腺素能、胆碱能神经和肽类神经一样重要。若其功能异常就可能引起一系列疾病。另据报道，NO在胃肠神经介导胃肠平滑肌松弛中起着重要的中介作用，在胃肠间神经丛中，NOS和血管活性肠肽共存并能引起非肾上腺素能非胆碱能（nonadrenergic-non-cholinerrgic,NANC）舒张，但血管活性肠肽的抗体只能部分消除NANC的舒张，其余的舒张反应则能被N-甲基精氨酸消除。NO作为NANC神经元递质，在泌尿生殖系统中起着重要作用。成为排尿节制等生理功能的调节物质，这为药物治疗泌尿生殖系统疾病提供了理论依据。4.4.2儿茶酚胺类神经递质分析儿茶酚胺类（catecholamines,CAs）是络氨酸衍生物的总称，包括多巴、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和5-羟色胺等物质。CAs类物质是人体一类重要的神经递质和激素，对心血管、神经等组织系统的生理活动起着调控作用，与一些功能性疾病以及器质性的病变有密切关系。研究这类物质的分析方法，对于了解他们在生命体内的调控机制以及相关的药理学研究和疾病诊断均具有十分重要的意义。第12页4.4.3兴奋剂检测（dopingcontrol）兴奋剂是IOC和其他国际体育组织所确定的禁用药物（滥用药物，doping），运动员以非正常量服用这些药物后可以在某种程度上提高他们的竞赛能力。从本质上讲，兴奋剂是一类对人体生理机能有重要影响的刺激性药物，是一类特殊的生物活性小分子。第13页第14页欺骗公众，欺骗法律，欺骗家人，欺骗自己，骗了七年，马里恩·琼斯终于累了！看着她泪流满面的照片，读到她交回奖牌，还会锒铛入狱的消息，不知为何，并不因此而十分憎恨、厌恶她，反倒涌动着些许同情。5枚奥运奖牌得主、美国“女飞人”琼斯欺骗之后是良心的折磨，悔恨的泪水只是对犯罪的忏悔，却不能洗刷掉对奥运精神的玷污，监狱将成为琼斯完成自我救赎的驿站。据日本共同社报道，国际柔道联盟(IJF)7日在突尼斯举行理事会，正式决定对在2009年8月荷兰世锦赛上药检结果呈阳性的北京奥运会柔道女子78公斤以上级冠军佟文处以2年禁赛处罚，禁赛期至2019年9月结束。佟文蝉联三届世锦赛冠军时所获金牌将被取消，但亚军及以下名次不会顺位上升。佟文的恩师、教练吴卫凤。“她（佟文）应该是无意中吃了含有大量瘦肉精的排骨才造成这样的后果。”许多化学物质被称为瘦肉精，主要有莱克多巴胺、盐酸克仑特罗(肾上腺类神经兴奋)、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特罗、盐酸多巴胺等7种。其中培林（雷托巴胺，莱克多巴胺，Ractopamine）毒性极低、代谢快速（无累积性），因此被美国等国家允许添加入猪饲料，日本也允许使用培林（Ractopamine）的猪肉进口。目前全世界有美国等24国开放使用培林，有160多国仍禁用。瘦肉精?Tobeornottobe，1.作用于神经系统以增强体力的刺激剂，如苯丙胺、麻黄碱、咖啡因、可卡因等42种；2.能产生快感和心理亢奋而降低痛感的麻醉剂，该类药物多有成瘾性，如哌替啶、吗啡等19种；3.具有镇静作用而抑制支气管及血管平滑肌舒张的β-阻断剂，如比索洛尔、梭达罗等9种；4.用以增加肾脏对尿的排泄速率使禁用药物在尿液中不易检出的利尿剂，如依他尼酸、苄氟噻嗪米等15种；第17页IOC规定的兴奋剂可分为下述七类：5.用以遮蔽检测重要性生理指标的掩蔽剂，如表睾酮等4种；6.用以增长肌肉和逆转蛋白损失的合成类固醇，常见的有氯睾酮、达那唑、大力补、美雄酮等16种雄性激素衍生物；7.增强体内红细胞数目并提高血液载氧能力的肽类激素（内源性），包括红细胞生成素（EPO）、绒毛膜促性腺激素（HCG）、生长激素、促肾上腺皮质激素等4种。第18页第19页1、兴奋剂检测的基本要求与分析步骤（1）违禁药物在体内含量低；（2）违禁药物在体内代谢复杂，且有个体差异；（3）违禁药物在体内本身有，需检测内源性与外源性；（4）违禁药物不断出现。兴奋剂检测任务困难、艰巨，原因：第20页兴奋剂检测的总体要求•样品的预处理及分离、富集技术应简洁，尽可能保留待检出的所有成分；•分析方法在保证单一成分检测准确的同时，应尽量扩展检测范围并使之能同时检出多种成分；•检测方法对检测物的灵敏度要高；•仪器检测方面宜发展高效分离和检测低限的检测技术。第21页样品的类型主要有三种：即尿样、血样和发样尿样是兴奋剂检测中最常用的手段，其主要原因为取样容易、预处理简单、尿中药物及其代谢产物浓度高于血中，样品易于保存；血检的优点在于可以检测出尿样无法检出的促红细胞生长因子（EPO）等物质；发检可提供滥用者服用禁药数月之后的证据。Dopingcontrol取样赛后1h，名次、随机A、B样预处理A样多份，酸、碱、酶化组筛选阴、阳确证和复审阳性、重检第22页2、兴奋剂检测的一般技术兴奋剂样品时一个复杂体系，它不仅存在正常食物引入的化学/生物物质和嫌疑外源性违禁物，同时也含有人体正常生理过程的分泌/代谢产物-内源性物质。因此，兴奋剂样品分离效率、监测方法的灵敏度是影响检测结果可靠性的关键因素。第23页分离方法主要依靠色谱法：GC、TLC、HPLC和MEKC。检测器兴奋剂的浓度很低，检测器的灵敏度是重要依据。色谱法中先后采用氢焰离子化检测器（FID）、氮磷检测器（NPD）和质谱检测技术。第24页GC-MS一直是IOC进行兴奋剂检测的最有力工具之一。目前普遍采用质谱-质谱联用（MS/MS）、高分辨质谱（HRMS）和多离子检测等技术。这些方法成功检测2ng/ml的康力龙、克伦特罗、5β-4-羟基甲睾等兴奋剂。第25页3、内源性激素的检测与策略第26页刺激剂、合成类固醇、β-阻断剂等传统兴奋剂检测方法已近完善，但一些内源性激素成为兴奋剂检测的难点。如睾酮