CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒.pdf

CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒货号规格BDXB0002-55ml(500次)BDXB0002-1010ml(1000次)BDXB0002-3030ml(3000次)保存：4℃避光保存（保质期1年），或-20℃避光保存（保质期2年）。避免反复冻融。产品概述CCK-8（CellCountingKit-8）是一种基于WST（水溶性四唑盐，一种类似于MTT的化合物）的细胞增殖与活性检测试剂盒，是用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下，WST被线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则培养基的颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。CCK-8法与MTT法的比较CCK-8法MTT法1还原后的甲臜是水溶性的（不需要溶解）还原后的甲臜是非水溶性的（需要加有机溶剂溶解）2重现性好重现性差3操作简单操作繁琐4测定波长：450-490nm测定波长：550-600nm5单一溶液，即开即用需要加有机溶剂，有毒性用途用于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞增值的测定、细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便，试剂盒包含一管已经配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即开即用，无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶标仪上检测，适合大规模，高通量的样品检测。使用方法一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。2.按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。3.接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（适用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，尤其加入CCK-8后的培养时间要一致）。二、细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液（100μl/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃，5%CO2）。2.向每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD的读数）。3.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。4.用酶标仪测定450nm处的吸光度。5.如果暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl的0.1M的HCl溶液或1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存，24小时内吸光度不会发生变化。三、细胞增殖-毒性检测（以96孔板为例）1.在96孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl约2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl约5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行预培养。2.向培养板加入1-10μl不同浓度的待测药物刺激。3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24或48小时）。4.每孔加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μlCCK-8溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。5.在细胞培养箱内继续孵育1-4小时（对于大多数情况孵育1小时就可以）。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时候分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。7.如果暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl0.1M的HCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光室温保存，24小时内吸光度不会发生变化。注意：如果待测物质有氧化或还原特性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（先用培养基洗涤细胞两次），去掉药物影响。如果药物影响比较小，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。活力计算细胞活力*（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力注意事项1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。2.CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。3.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。4.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要查到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰OD读数。5.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μl培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500个/孔（100μl培养基），且培养时间长一些。如果要使用24孔板或6孔板实验，需先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。6.加入CCK-8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或pH值变化，建议换用新鲜的培养基。7.如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在450-490nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。8.酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。细胞增殖分析方法备注制备细胞悬液↓接种到96孔培养板↓37℃培养（注1）↓加入10μl的CCK-8（注2）↓培养1-4s（注3、注4）↓测定450nm吸光度（注5）1.细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，不需要贴壁的话，可以省去这个步骤。2.由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.细胞的种类不一样，形成的甲臜的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的甲臜很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。4.如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以帮助混匀。5.建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。图1细胞数目和吸光度的相关曲线细胞毒性分析方法备注制备细胞悬液↓接种到96孔培养板↓37℃培养（注1）↓加入不同浓度的毒性物质（注2）↓加入10μl的CCK-8（注3）↓培养1-4小时（注4、注5）↓测定450nm吸光度（注6）1.细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，不需要贴壁的话，可以省去这个步骤。2.加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的周期。3.由于每孔加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。4.细胞的种类不一样，形成的甲臜的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的甲臜很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。5.如果颜色不均匀的话，可以轻轻敲击培养板以帮助混匀。6.建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。图2细胞毒性曲线IC50的计算方法按照以下公式计算细胞存活率，绘制成图表，细胞存活率50%的值即为IC50%细胞存活率（%）=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%As:实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、毒性物质）Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8，无毒性物质）Ab：空白孔（含有培养基、毒性物质、CCK-8，无细胞）常见问题Q1.设定参比波长的目的是什么？必须要设定吗？A1.不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长处没有吸光度，设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。Q2.如何设定空白对照？A2.可以在不含细胞、含有药物的培养基中加CCK-8，测定450nm的吸光度最为空白对照。Q3.在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？A3.有时会有影响。如果药物具有氧化或还原特性，会和CCK-8发生反应，吸光度发生变化。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度与不含药物的培养基（加CCK-8）的吸光度相比有明显变化，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。Q4.不更换培养基加CCK-8试剂，有没有问题？A4.一般没有问题。但是如果培养基里有氧化或还原性物质的话，可能会产生误差，必须更换其他培养基。以下培养基会影响测定：培养基IMDM的空白吸收1.0；培养基McCoy/s的空白吸收0.3。Q5.哪些物质会影响CCK-8的测定？A5.当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增加OD值；在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，减小OD值；在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可；血清不影响测定。Q6.说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CCK-8试剂？A6.一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10.Q7.如何减少由于CCK-8试剂在枪头或者孔壁上的残留所带来的误差？A7.可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。Q8.每次测定的OD值不一样，是什么原因？如何解决？A8.可能会有以下几个原因：1.当在培养箱中培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，导致培养基的体积不一样，从而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3.每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000-100000个/孔范围内摸索条件。Q9.在CCK-8显色过程中，如何终止反应？A9.有以下几种方法（96孔板）注意：反应停止后，应在24小时内测定。1.每孔加10μl的0.1MHCl溶液。2.在显色反应后，将培养板放入4℃冰箱内。3.每孔加10μl1%(w/v)的SDS溶液。Q10.在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？A10.缩短加入CCK-8后的培养时间。Q11.必须预培养细胞吗？A11.不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞的预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有研究人员不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。Q12.如果加入的药物中有金属，是否会有影响？A12.金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。Q13.CCK-8的保质期有多久？A13.CCK-8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存，我们推荐在-20℃储藏。正常的CCK-8颜色为浅红粉色，如有明显颜色变化，则CCK-8的质量有可能发生变化。CCK-8若反复冻融有