MTT法检测细胞活性

MTT法检测细胞活性【实验目的】了解体外筛选抗肿瘤药物（细胞毒）的方法，掌握酶标仪的使用方法及MTT实验的原理。【实验原理】MTT是3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐的简称，它是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死亡细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物。在一定的细胞数范围内，MTT结晶物的量与细胞数成正比，故用酶联免疫检测仪在490/570nm波长下测定其吸光值，可间接反映活细胞的数量。体外培养的肿瘤细胞具有无限增殖的功能，在培养过程中给予一定浓度的海洋药物，用MTT法可以明确这些药物是否可以抑制细胞增殖，并比较不同药物抑制作用的强弱。【实验器材与药品】人胃癌细胞。细胞用1640培养基（加10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）在37℃、5％CO2饱和水汽CO2培养箱中常规培养，细胞传代以0.25％胰酶消化、酶标仪，96孔细胞培养板，加样枪、DMSO，MTT(5mg/ml)【实验方法与步骤】1.将胃癌细胞以5×103/ml密度接种于96孔板（每孔加200ul），培养至指数生长期（24H），加入不同浓度的丁酸钠(促进胃细胞生长)（200,120,80,40mM）。每组3个复孔。同时设空白对照组。（接种方式如图）2.24或48小时后，小心吸去上清，加入90μl新鲜培养液，再加入10ulMTT溶液，继续培养4h弃上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。（CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。）3.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定复孔。细胞生长抑制率=(对照组的A值-实验组的A值)/对照组的A值100%.【实验结果】1．绘制药物对细胞抑制曲线2．比较不同药物对细胞生长抑制情况3．比较同一药物作用不同时间对细胞增殖情况的影响【注意事项】1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。2.MTT溶液为黄色需避光保存，长时间光照会导致失效。当颜色变为灰绿色时，请勿使用。3.二甲亚砜溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。【思考题】比较细胞计数与MTT法测试结果的关系。