蛋白质与蛋白组学ppt课件

第三章Protein，proteomeandproteomics蛋白质、蛋白质组与蛋白质组学Protein是执行生命功能的大分子结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白一、蛋白质的化学组成二、蛋白质分子结构三、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质的分离纯化五、蛋白质的理化性质六、蛋白质分子序列及空间结构分析第一节蛋白质的结构与功能一、蛋白质分子的化学组成C、H、O、N、S等普遍存在，部分蛋白质含有P、Se或其他金属元素。蛋白质的N元素含量较为稳定，平均含氮量约为16％N克数/每克样品×6.25×100=蛋白质含量（g%）(一)组成蛋白质的氨基酸种类体内Pr由20种α-氨基酸（aminoacidAA）构成。除Gly外，均为L-α-AAAA侧链COO-HCαNH3+R根据R不同将20种AA分为四类：①非极性疏水性氨基酸②极性中性氨基酸③酸性氨基酸④碱性氨基酸①非极性疏水性AAAA的R侧链是脂肪烃或芳香烃-----疏水基团。烃链越长疏水性越大。存在部位：常因相互疏水作用而处于球状蛋白内部或生物膜的跨膜双脂层中。②极性、中性AA（不解离极性AA）AA的R侧链是带有极性的烃基、巯基和酰胺基团，故有亲水性，但不解离.(二)氨基酸的理化性质+H+-H+-H+H++1.氨基酸是两性电解质AA等电点（isoelectricpH,pI）当溶液的pH值达到某一特定值时，AA所带正负电荷相等，AA分子净电荷为零，对外不显电性时溶液的pH值称之。2.AA分子的水溶性AA由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解度不同，据此将AA分为：亲水类：Arg/Asp/Asn/Glu/Gln/Cys/Gly/His/Lys/Thr/Ser疏水类：Ala/Ile/Leu/Met/Phe/Pro/Trp/Tyr/ValAA的侧链可以直接影响Pr或者多肽链的空间折叠方式。胞质蛋白中富含疏水氨基酸的构成肽段大多折叠于蛋白质分子的内部，而亲水氨基酸构成肽段则排列于蛋白质表面。3.部分AA有紫外吸收峰色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸都有芳香环侧链，其中的共轭双键可以在280nm的紫外线形成吸收峰，可作为分析样品中Pr含量的方法。4.茚三酮反应茚三酮和α-AA共热，AA脱去其α氨基和α羧基，茚三酮被还原，产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物，在570nm具吸收峰，由于吸光度与AA脱氨量有关，可据此测定AA含量.5.成肽反应AA之间可以通过氨基和羧基脱水缩合形成酰胺结构，连接的化学键叫做肽键（peptidebond）二、蛋白质分子的结构蛋白质或多肽是AA的聚合体，氨基酸通过肽键连接形成肽（peptide）。肽平面:肽中AA之间肽键的六个原子在同一平面，连接羧基的α1碳原子和连接氨基的α2碳原子在对角位置。Motif模体结构域Pr的二级结构（secondarystructure）：Pr分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，不涉及AA侧链的构象化学键：H键α螺旋（αhelix）β折叠（βsheet）β转角（βturn）无规卷曲（randomcoil）蛋白质的一级结构（primarystructure）：肽链中AA残基（residue）的排列次序。化学键：肽键、二硫键空间结构的折叠需要分子伴侣的参与α螺旋结构β折叠β转角γ转角1与3氨基酸残基之间形成氢键。17蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构(supersecondarystructure）*：由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。是特殊的序列或结构的基本组成单元，又称基序或模序（motif)*.可进一步组建成结构域。超二级结构包括：αα、ββ、βαβ组合。钙结合蛋白中结合钙离子的模序锌指结构蛋白质的三级结构tertiarystructure一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置化学键：氢键、疏水作用、离子键、范德华力结构域(domain)：在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成半独立较紧密的球状结构，具有简单的生物学功能。结构域是多肽链的一个部分,它们可用限制性蛋白酶从多肽链上切割下来而不改变其性质。结构域的组合就形成了Pr的完整三级结构。催化结构域NAD+结合结构域19结构域有两个重要的功能*：第一，像亚基那样，能作为一个模式结构来有效地参与蛋白质分子的装配。独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘曲过程简化为个别的简单步骤。这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。第二，结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及巨大结构的装配具有决定作用。蛋白质的四级结构蛋白质四级结构（quaternarystructure）指的具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局化学键：各亚基之间主要靠疏水作用相互结合，氢键、离子键和范得华力也参与四级结构的维持。亚基（subunit）：蛋白质四级结构中独立结构的肽链四级结构的蛋白质，单独的亚基没有生物活性三、蛋白质分子结构和功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持一级结构相似的蛋白质，其构象及功能也相似促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(MSH)均为垂体分泌的多肽激素。ACTH4～10位的氨基酸结构与β－MSH的11～17位一样，故ACTH有较弱的MSH的生理作用Pr一级结构中参与功能活性的残基(关键部位)，发生异常改变其功能镰状RBC贫血(βGlu→Val)22镰刀型红细胞性贫血：*仅发生在一级结构中：β6Glu换成β6Val由此引起：三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合结果：导致红细胞发生溶血蛋白质的功能与其空间构象密切相关构象发生变化，其功能活性也随之改变：在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应(allostericeffect)。如：寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象，这种构象的变化传递可影响其他的亚基构象，进而改变了分子的生物学活性。协同作用--各亚基之间的相互作用是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。正协同效应：如果1个亚基和配体结合，使另1个亚基与配体的结合更容易了负协同效应：若亚基结合的配体相同，为同种协同效应，如配体不同则为异种协同效应蛋白质的结构与功能之间的关系主要表现在两方面：1.蛋白质的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。2.蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重要保证。四、蛋白质的理化性质(一)蛋白质的两性解离蛋白质除了N端的氨基和C端的羧基可以解离外，侧链中的某些基团在一定pH环境下也可以解离蛋白质分子所带电荷状况决定于特定pH环境下所有氨基酸残基可解离集团的的荷电情况。蛋白质的等电点（pI）：当蛋白质分子在某一pH值的溶液中解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为零时溶液的pH值(二)蛋白质的胶体性质蛋白质分子具有胶粒(0.001～0.1μm)的特性。其溶液稳定原因：1.表面常是亲水AA，可以结合水分子在蛋白质表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质分子相互靠近聚集，防止蛋白质析出。2.由于蛋白质带有电荷，同种电荷相互排斥使得蛋白质不能聚集。(三)蛋白质的变性、沉淀和凝固变性：在某些理化因素作用下，Pr空间构象被破坏从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失--蛋白质的变性（denaturation）。主要破坏二硫键和次级键，不涉及肽键。加热、乙醇等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以使蛋白质发生变性。复性：蛋白质变性如果程度较轻，在去除变性因素后恢复或者部分恢复其原有的构象和功能---复性（renaturation）蛋白质经强酸强碱变性后仍可以溶解于强酸强碱溶液中，将pH值调至等电点时，变性蛋白质立即变成絮状物，此絮状物仍可以溶解于强酸强碱溶液中，再加热时絮状物变为坚固的凝块，此凝块不再溶于强酸强碱，称为蛋白质的凝固（coagulation）蛋白质的沉淀、凝固变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶液中析出的现象-蛋白质的沉淀。(四)蛋白质的紫外吸收蛋白质含有芳香族氨基酸，在280nm处有吸收峰。在一定范围内,蛋白质溶液浓度与A280nm成正比。(五)蛋白质的呈色反应Pr水解产生AA也可发生茚三酮显色反应Pr在稀碱溶液中和硫酸铜共热时可以呈现紫色或者红色，称为双缩脲反应。(一)透析(dialysis)及超滤原理：利用Pr不能透过半透膜而将Pr与小分子物质分开截留分子量的超滤膜（正压或离心）半透膜五、蛋白质的分离纯化（二）常用沉淀方法1.盐析(saltprecipitation)原理--将（NH４）2SO4、Na2SO4、NaCl等加入蛋白质溶液，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。2、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀（1）原理：极性较大有机溶剂破坏pr水化层导致Pr沉淀析出；（2）0～4℃，丙酮10倍于Pr溶液体积，尽快操作，防止变性。3.免疫沉淀Pr具有抗原性，用特异抗体形成免疫复合物，沉淀分离（三)电泳（electrophoresis)：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。电泳：通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。分类：纸电泳凝胶电泳等（四）应用相分配或亲和原理-层析分离(chromatography)层析也叫色谱是分离蛋白质常用的方法：当蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少、亲和力差异等不断将蛋白质在固定相中重新分配，并且以不同速度流经固定相。层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负电荷的蛋白质成分就与固定相结合，而带正电荷的成分则完全通过固定相，进一步用带负电荷的溶液（如Cl-）洗脱固定相就可以得到蛋白质。离子交换层析---阳离子交换层析（阴离子交换层析）依据：Pr和AA一样，是两性电解质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同。35固定相：1.纤维素---DEAE纤维素、CM纤维素2.葡聚糖凝胶过滤(gelfiltration)（分子筛）原理：层析柱中填满带有小孔的颗粒（一般由葡聚糖制成）。Pr溶液加于柱的顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子Pr不能进入孔内而径直流出，因而不同大小的Pr得以分离。3738常用过滤层析凝胶的截留分子量范围39亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一分子可逆结合的特性。如，酶的活性部位能和底物\抑制剂\辅助因子专一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.[酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结合蛋白与结合物之间]。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。40固定相--配基固定在固相载体上(五)利用蛋白质颗粒沉降行为-超速离心（ultracentrifugation)原理：Pr在高速离心时，在溶液中逐渐下降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同Pr其密度与形态不同，沉降停止的位置就不同，从而达到分离Pr的目的。密度梯度离心六、蛋白质分子序列及空间结构分析蛋白质序列测定：Sanger逐级降解、末端分析、再结合Edman降解法测定肽段的AA序列基因着手---先找到编码特定蛋白质的DNA序列及mRNA序列，推出AA序列。空间结构测定：物理方法X衍射，核磁共振等，计算机辅助—生物信息学第三章蛋白质、蛋白质组与蛋白质组学高等教育出版社43第二节蛋白质组与蛋白质组学1994年9月在意大利MarcWilkins正式提出了蛋白质组（proteome）的概念。用于指代特定时间一个基因组或者一种组织产生并利用的所有蛋白质。差异蛋白质组学的研究方法和应用(一)差异蛋白质组学的研究内容比较蛋白质组学寻找不同生理或者病理状态下组织或细胞的蛋白质组变化，鉴定并研究这些差异蛋白在生命过程中的作用。1.蛋白质鉴定2.蛋白质的修饰3.蛋白质功能确定1.蛋白质鉴定用电泳结果分析差异蛋白分子量、pI等,结合蛋白杂交、免疫学检测初步鉴定蛋白质种类。2.蛋白质