第二章--光谱分析仪器与技术

第二章光谱分析仪器与技术钱士匀目录第一节吸收光谱分析仪器与技术第二节发射光谱分析仪器与技术第三节散射光谱分析仪器与技术重点提示1.光的基本性质和朗伯-比尔定律的意义是什么？2.光谱分析技术如何分类，各有哪些技术特征？3.紫外-可见分光光度计按其光学系统可分为哪几类，各有何特点？4.原子吸收分光光度计的结构组成及影响测定灵敏度和精确度的因素有哪些？5.简述原子发射光谱分析的特点及其局限性。6.荧光光谱仪的种类和基本结构有哪些？影响荧光强度的因素有哪些？7.散射光谱技术分析方法有哪两类？简述其检测原理。8.根据雷莱光散射理论，散射光强度主要与哪些因素有关？光谱分析技术•光谱分析技术是利用物质具有发射光谱、吸收光谱或散射光谱的特征，对物质进行定性、定量分析的一类分析方法。•光谱分析依据光谱特征可分为吸收光谱分析技术、发射光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。•光谱分析技术在生物化学检验中是最基本和最常用的，它因具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛使用。第一节吸收光谱分析仪器与技术一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（一）光的基本性质–光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。–光的波长可用纳米（nm）为单位来表示。E=hμ（二）光的选择吸收与物质颜色的关系–物质的分子或离子团对可见和紫外光区的光波具有选择吸收作用。–可见光谱分析要求被测溶液的颜色与所用的单色光互补，以求达到溶液对光的最大吸收。•吸收光谱（absorptionspectrum）：不同的物质会吸收不同波长的光。改变入射光的波长，并依次记录物质对不同波长光的吸收程度，就得到该物质的吸收光谱。第一节紫外-可见分光光度计的工作原理和基本结构各种试液的紫外扫描图谱A一葛根素；B～空白微乳；c一空白肠循环液；D一酚红吸收光谱：又名吸收曲线。不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A（波长做横坐标，吸光度做纵坐标）作图一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（三）紫外-可见分光光度技术紫外光（200～400nm），可见光（400～780nm）1.朗伯-比尔定律一束单色光通过物质溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。A=KCbA为吸光度；K为比例系数；C为吸光物质的浓度；b为溶液的液层厚度。当K、C一定时，吸光度A与液层厚度b成正比，称为朗伯定律（Lambert定律）；当K、b一定时，吸光度A与溶液浓度C成正比，称为比尔定律（Beer定律）。一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术1.朗伯-比尔定律（1）吸光度：吸光度表示单色光通过溶液时被吸收的程度，以A表示。（2）透光度：透光度又称为透光率，表示透过光占入射光的比例，以T表示。吸光度与透光度之间的关系：A=log=﹣logT（3）比例系数K：K值表示单位浓度、单位液层厚度溶液的吸光度，是与吸光物质性质及入射光波长有关的常数。K值的表示方法依赖于溶液浓度的表示方法。吸收系数a、摩尔吸收系数ε、百分吸收系数。一、紫外-可见分光光度计的工作原理kbcIIT100朗伯-比尔定律：I0：入射光强度b:液层厚度T:透光度k:吸光系数kbcTIIIITA1lglglglg00C:溶液浓度I:透射光强度A:吸光度一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术2.定量分析的方法（1）直接比较法：分别测出试样溶液及标准溶液的吸光度Ax及As，进行比较可求得样品的浓度。Cx=AxCs／As（2）标准曲线法：一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术2.定量分析的方法（3）摩尔吸光系数（ε=K）检测法：在给定条件（单色光波长、溶剂、温度等）下，吸光系数是表示物质特性的常数。根据朗伯-比尔定律，可以用C=A/εb公式直接计算物质的含量。（4）双波长分光光度法（补充）：当吸收光谱相互重叠的两种组分共存时，利用双波长分光光度法可对单个组分进行测定或同时对两个组分进行分析。1、朗伯-比尔定律：A=KCb2、吸光度与透光度：A=log=﹣logTA：吸光度；I。：入射光的强度；I1：透射光的强度；T：透射比，或称透光度；K：系数，可以是吸收系数或摩尔吸收系数b：吸收介质的厚度，一般以cm为单位；C：吸光物质的浓度，单位可以是g/L或mol/L。3、直接比较法（有标准溶液时）：Cx=AxCs／As4、摩尔吸光系数（ε）检测法（在给定条件（单色光波长、溶剂、温度等）下）：C=A/εb5、吸光系数K:(A＝kbc)(1)k与入射波长、溶液的性质以及温度有关。吸收物质在特定波长和溶剂条件下的特征常数；不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关；入射光I0透射光It（2）是物质吸光能力的量度，可作为定性鉴定的参数；同一物质在不同波长下的k值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以kmax表示。Kmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。（3）k在数值上等于单位浓度为、单位液层厚度为时特定溶液在某一波长下的吸光度。浓度单位不同：吸收系数a、摩尔吸收系数ε、百分吸收系数一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（四）紫外-可见分光光度计的基本结构1.光源可见光区：钨灯、卤钨灯光源，波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯光源，波长185～400nm。一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（四）紫外-可见分光光度计的基本结构2.单色器将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的光学装置，由棱镜或光栅、狭缝和准直镜等部分组成。常用单色器：棱镜、干涉滤光片、光栅分光。3.吸收池分光光度计中用来盛放溶液的容器，又称比色皿或比色杯。多用石英比色杯，适用于紫外和可见光区；玻璃比色杯只能用于可见光区。自动生化分析仪多用塑料比色杯。一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（五）紫外-可见分光光度计的类型1.单光束分光光度计（1）单光束可见光分光光度计1.光源；2.聚光透镜；3.色散棱镜；4.准直镜；5.保护玻璃；6.狭缝；7.反射镜；8.光栅；9.聚光透镜；10.吸收池；11.光门；12.保护玻璃；13.光电倍增管一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（五）紫外-可见分光光度计的类型1.单光束分光光度计单光束紫外-可见分光光度计一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（五）紫外-可见分光光度计的类型2.双光束分光光度计一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（五）紫外-可见分光光度计的类型3.双波长分光光度计一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（六）分光光度计分析条件的选择1.入射光波长的选择选择最强吸收带的最大吸收波长（λmax）的单色光为入射光，以得到最大的测量灵敏度。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。2．吸光度范围的选择选择适宜的吸光度范围，以保证测量结果的误差最小。吸光度范围为0.1～2.0时，测定结果的相对误差最小。一、紫外-可见分光光度分析仪器与技术（六）分光光度计分析条件的选择3.狭缝宽度的选择狭缝宽度影响测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。狭缝宽度增大，入射光的单色性降低，会使灵敏度下降，校准曲线偏离朗伯-比尔定律。狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的1/10。4.显色反应条件的选择①反应的生成物的摩尔吸光系数较大；②反应应有较高的选择性；③反应生成物有足够的稳定性；④反应生成物的组成恒定。二、原子吸收分光光度分析仪器与技术（一）原子吸收分光光度法原理ΔE=E2－El=hν式中：ΔE为能级差；E2、E1分别为高、低能级的能量；h为普朗克常数；ν为吸收光的频率。电子从低能级跃迁到高能级时，需要吸收特定波长的光。用特定波长的光去照射待测元素，待测元素就会吸收一部分光能而被激发，使得入射光变弱、变暗，如同溶液对单色光的吸收。利用光电检测器检测出入射光线的强度变化即待测元素的吸光度，根据朗伯-比尔定律，得到待测元素的浓度。二、原子吸收分光光度分析仪器与技术（二）原子吸收分光光度计的基本结构1600条谱线二、原子吸收分光光度分析仪器与技术（二）原子吸收分光光度计的基本结构1．光源能够产生待测元素所需的特征线性光谱，谱线的宽度要窄，发射强度要高，还要十分稳定。常用的光源为空心阴极灯。2．原子化器提供合适的能量，将样品干燥、蒸发并转化为所需的基态原子蒸气。原子化器有火焰原子化器与石墨炉原子化器。二、原子吸收分光光度分析仪器与技术（二）原子吸收分光光度计的基本结构3．分光系统（单色器）单色器由入射和出射狭缝、反射镜和色散元件等组成，作用是将所需的共振吸收线与邻近干扰线分离。4．检测系统由检测器、放大器、对数变换器和显示装置组成。检测器的作用是进行光电信号转换变成电信号，然后再经放大，滤波后，被测信号进行对数变换，变成线性信号，最后由读出装置显示读数或由记录仪记录下来。二、原子吸收分光光度分析仪器与技术（三）原子分光光度计分析条件的选择1．吸收波长①选择元素的共振线作为分析线；②分析浓度较高的样品时，可选择灵敏度较低的谱线进行分析；③有些元素的共振线靠近远紫外区，最好用背景吸收校正法扣除背景吸收，若浓度较高，可改用次灵敏线作为分析线。2．灯电流在所选的电流下，光源能够提供足够强和稳定的入射谱线，以提高信噪比和测定精确度；同时，还要有较高的测定灵敏度。二、原子吸收分光光度分析仪器与技术（三）原子分光光度计分析条件的选择3．狭缝的宽度狭缝宽度的选择应以能分开分析线与邻近线为原则。4．燃烧器的高度必须使测量光束从自由原子浓度最大的火焰区域通过。5．雾化器的调节一般约4ml/min的进样量是比较合适的。第二节发射光谱分析仪器与技术一、原子发射光谱分析仪器与技术（一）原子发射光谱分析基本工作原理当原子受到外界能量的作用时，原子由于与高速运动的气态粒子和电子相互碰撞而获得了能量，使原子中外层电子从基态跃迁到激发态，使样品蒸发并将各组分转变成气态原子或离子，引起气体中各基本粒子的电激发。被激发的原子或离子回到基态时发射出每个元素的特征谱线。研究特征谱线的波长和强度就可以对被测样品进行定性和定量分析。原子发射光谱分析对一个试样既能同时进行多元素分析，又可测定元素各种不同的含量（高、中、微含量）。具有分析速度快，选择性、准确性高，检出限低，样品消耗少等优点。一、原子发射光谱分析仪器与技术（二）原子发射光谱分析仪器1.仪器基本结构原子发射光谱仪由激发光源和光谱仪两部分组成。（1）激发光源：提供使试样中被测元素原子化和原子激发发光所需要的能量，使样品蒸发、原子化、激发，产生光谱。常用火花式与电感耦合等离子体两种方式。（2）光谱仪：常用的光谱仪有棱镜摄谱仪、光栅摄谱仪和光电直读光谱仪。光谱仪的作用是将光源发射的电磁辐射色散后，得到按波长顺序排列的光谱，并对不同波长的辐射进行检测与记录。一、原子发射光谱分析仪器与技术2.原子发射光谱分析方法（1）定性分析方法元素的特征谱线波长是由元素的原子性质所决定的。通过检查谱图上有无特征谱线的出现来确定该元素是否存在。（2）定量分析方法：根据样品中被测元素的谱线强度来确定其元素含量的方法。元素的谱线强度与该元素在试样中浓度c的相互关系：I=acb式中：I为被测元素谱线强度；a是与样品的蒸发、激发过程和样品组成等有关的一个参数；c为被测元素的浓度；b为自吸系数，其数值与谱线的自吸有关。一、原子发射光谱分析仪器与技术（三）原子发射光谱分析的干扰与处理基体效应是其他元素的存在影响被测元素谱线强度的干扰作用。样品组成越复杂，基体效应越明显，分析误差越大。向样品和标准样品中加入经过选择的辅助物质，如光谱缓冲剂或光谱载体，以消除或减少基体干扰。光谱缓冲剂可稀释样品，能控制样品在弧焰中蒸发、激发的温度和降低背景影响。光谱缓冲剂纯度要高，谱线简单。按所起的作用不同。光谱载体的作用是改变样品中被测元素的熔点、沸点，从而改变