15遗传性疾病的分子诊断

分子诊断学南方医科大学第十五章遗传性疾病的分子诊断基因工程研究所南方医科大学分子诊断学南方医科大学教学目的与要求了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。掌握遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。重点遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。难点遗传性疾病的分子机制。分子诊断学南方医科大学本章目录第一节遗传性疾病分子诊断的策略***第二节遗传病的分子诊断第三节产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断****分子诊断学南方医科大学第一节遗传性疾病分子诊断的策略*一、直接诊断策略二、基因多态性连锁分析三、基因突变的定量（dosage）诊断分子诊断学南方医科大学一、直接诊断策略定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变类型：点突变缺失插入倍增前提：基因已经克隆，序列和结构清楚分子诊断学南方医科大学(一)点突变的诊断1、基因背景清楚的点突变等位基因特异性寡核苷酸杂交(allelespecificoligonucleotide,ASO)PCR-ELISA等位基因特异性扩增(allelespecificamplification,ASAPCR-RFLP测序基因芯片技术等进行诊断分子诊断学南方医科大学2、基因背景未知的点突变单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)异源双链分析(heteroduplexanalysis,HA)DNA序列测定蛋白截短测试（proteintruncationtest,PTT）分子诊断学南方医科大学(二)片段性突变的检测（1）少数核苷酸缺失或插入检测点突变的方法（2）大的片段突变Southern印迹技术、多重PCR技术。片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变，碱基的缺失、插入、扩增和重组。分子诊断学南方医科大学二、基因多态性连锁分析检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提：致病基因尚未被定位和阐明基因太大突变种类太多检测方法：RFLP，VNTR，STR，SNP分子诊断学南方医科大学三、基因突变的定量诊断检测方法：细胞分裂中期染色体检测固相杂交PCR扩增检测内容：大范围的重复、缺失分子诊断学南方医科大学方法分辨率(碱基数)说明细胞分裂中期染色体检测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5x106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH5x104用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列CGH5x104使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterialartificialchromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH不确定将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星PCR1x102取决于缺失区已知的微卫星；差异PCR1x102要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争PCR1x102准确，结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；Real-timePCR1x102成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBRGreen染料或探针，应用越来越广泛；长片段PCR1x102检测基因内缺失比重复更有效，可以确定突变的性质。分子诊断学南方医科大学第二节遗传病的分子诊断一、血红蛋白病二、血友病三、肌营养不良症四、苯丙酮尿症五、囊性纤维化六、亨廷顿病七、脆性X综合征分子诊断学南方医科大学一、血红蛋白病血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。分子诊断学南方医科大学珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11分子诊断学南方医科大学11ｐ15.5珠蛋白基因簇:分子诊断学南方医科大学血红蛋白的类型成人Hb：HbA2297～98%HbA2222～3%胎儿Hb：HbF22α2Gγ2α2Aγ2胚胎Hb：HbGowerⅠ22ζ2Gγ2ζ2Aγ2(妊娠12周内)HbGowerⅡ22HbPortland22分子诊断学南方医科大学血红蛋白类型分子诊断学南方医科大学血红蛋白病hemoglobinopathy结构异常血红蛋白病镰刀状细胞贫血；不稳定血红蛋白病血红蛋白M病氧亲和力改变地中海贫血，珠蛋白的合成降低或消失分子诊断学南方医科大学1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。分子诊断学南方医科大学N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)镰刀状细胞贫血分子机制GTGCATCTGACTCCTGAGGAGGTGCATCTGACTCCTGTGGAG分子诊断学南方医科大学分子诊断方法限制性内切酶法（RE）ASOARMS、跨越断裂点的PCR(裂口PCR、gap-PCR)分子诊断学南方医科大学Sβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(SouthernBlot)MstIICCTNAGGGGANTCC1.15kb0.2kb1.35kbASSA分子诊断学南方医科大学Sβ肽链Aβ肽链ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(PCR-RFLP)DdeICTNAGGANTC268bpASSA175bp175268443分子诊断学南方医科大学思考题（作业）书中239页中关于HbE检测请回答下列问题（1）HbE的突变碱基改变情况(2)该突变位于蛋白质的第几个氨基酸（3）突变位点位于氨基酸哪一个外显子上（4）写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列（5’和3’端各5个碱基）(5)用MnlI酶切后，请列出各种可能的情况（6）结合所学习的知识，请再写出几种可能用于诊断的方法。分子诊断学南方医科大学2.地中海贫血由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。类型：α地中海贫血，β地中海贫血，γ地中海贫血，δ地中海贫血，以此类推。分子诊断学南方医科大学地中海贫血分子诊断学南方医科大学α地中海贫血每条16号染色体上有两个αGene——缺失程度不同，α链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型的地贫。若一条染色体上缺失一个α基因（／α－）为α+地贫，α链合成减少。若一条染色体上两个α基因均缺失（／－－）为α0地贫，α链不能合成。分子诊断学南方医科大学临床类型类型症状正常人静止型+地贫杂合子无症状轻型（标准型）0地贫杂合子轻度贫血+地贫纯合子血红蛋白H病0地贫和+地贫双重杂合子溶血性贫血HbBart’s胎儿水肿综合征0地贫纯合子胎儿水肿分子诊断学南方医科大学胎儿水肿分子诊断学南方医科大学α地贫的分子基础依α基因缺陷程度分为：1Gene缺失型（缺失1～４个α基因）2非Gene缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等结果1生成无功能或稳定性降低的mRNA无义突变移码突变终止密码突变起始密码突变2RNA加工突变3产生不稳定Hb分子诊断学南方医科大学α地中海贫血的分子机制分子诊断学南方医科大学分子诊断方法(1)PCR法PCR法已经成为鉴别缺失型α地中海贫血的首选方法。(2)ARMS法该法能快速鉴别诊断HbCS和HbQS(3)ASA法与ARMS法相类似(4)SSCP法非缺失型α2地中海贫血突变(5)等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法分子诊断学南方医科大学β地中海贫血β珠蛋白Gene突变或缺失→β珠蛋白链合成速率下降→溶血性贫血β0地贫：β链完全不能合成β+地贫：β链可部分合成分子诊断学南方医科大学β-地中海贫血临床分类临床类型基因型基因产物临床表现重型地贫+/+、0/00/0、+/0链几乎不能合成链合成相对增加HbF和HbA2增高地中海贫血面容溶血性贫血（需输血）轻型地贫+/A、0/A0/A能合成适量的链贫血不明显或轻度贫血中间型地贫+/+链部分合成介于重型和轻型之间（不需输血）遗传性胎儿血红蛋白持续增多症缺失或突变链和链合成受抑制链合成明显增加成人HbF持续增加，无症状分子诊断学南方医科大学患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血的特殊面容。分子诊断学南方医科大学X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，在骨皮质间出现垂直短发样骨刺分子诊断学南方医科大学-地中海贫血的分子基础地中海贫血已发现100多种突变类型，包括点突变和基因缺失。绝大多数地中海贫血是由于基因发生点突变所致，突变涉及基因内及侧翼序列。（1）编码区突变（2）非编码区突变（3）启动子区突变（4）RNA裂解信号突变（5）加帽位点单个碱基突变分子诊断学南方医科大学☆编码区突变——mRNA稳定性降低或形成无功能mRNA（1）无义突变密码子17：A→C密码子43：G→Tβ0地贫（2）移码突变密码子71/72：+A密码子41/42：－TCTTβ0地贫（3）起始密码突变ATG→AGGβ0地贫分子诊断学南方医科大学⑴内含子IGT→AT丧失一个剪切信号。⑵新的切点产生同义突变→激活→I和Exon隐蔽裂解位点如：GGT→AGT产生新的剪切点☆非编码区突变——影响mRNA剪切、加工过程分子诊断学南方医科大学GT→ATGGT→AGT，激活隐蔽剪切位点分子诊断学南方医科大学☆启动子区突变——降低mRNA的转录效率-28位A→G突变破坏了TATABox。分子诊断学南方医科大学☆RNA裂解信号突变——不能准确裂解和加polyAβ珠蛋白基因3’侧翼序列中AATAAA→AACAAA☆加帽位点单个碱基突变——不能准确裂解和加polyA加帽位点发生A→C颠换，影响转录效率。通常是mRNA的第一个核苷酸。分子诊断学南方医科大学分子诊断方法PCR反向点杂交(PCR-RDB)法PCR—RFLP法基因芯片法等ND1234658710911分子诊断学南方医科大学二、血友病人体的凝血过程需要多种凝血因子参加。由于凝血因子基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺如即造成血友病(hemophilia)。85％的血友病患者是由于血浆中缺乏凝血第8因子(FⅧ)所致，约10％的患者是由于缺乏凝血第9因子(FⅨ)，前者称为甲型血友病，后者称为乙型血友病。分子诊断学南方医科大学（一）甲型血友病及其分子诊断甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)即抗血友病球蛋白(antihemophilicglobulin,AHG)缺乏所导致的凝血机制异常的遗传性疾病。分子诊断学南方医科大学2．甲型血友病的分子机制在FⅧ基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于FⅧ基因的第22号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ功能完全丧失而发生严重的血友病。分子诊断学南方医科大学甲型血友病分子诊断（1）基因倒位的检测由于50％左右的甲型血友病是由于FⅧ基因中的22号内含子倒位引起的，所以检测该突变成为对患者进行基因诊断的首选方法。在检测基因倒位的方法中首选的是长距离PCR(LD-PCR)技术。分子诊断学南方医科大学(2)非基因倒位的检测点突变是非基因倒位引起甲型血友病的主要原因，因此对该类患者的家系分析和携带者的基因检测主要是通过点突变的检测技术进行。分子诊断学南方医科大学1)PCR-RFLP法2)VNTR法3)STR法4)PCR-SSCP法分子诊断学南方