地中海贫血基因检测的临床应用

地中海贫血基因检测的临床应用一、地中海贫血2全球有3.5亿人为地中海贫血基因携带者（占总人口的2%）中国南方高发地区人群携带率最高可达到24%3地中海贫血的地域分布α-地贫分布β-地贫分布中国南方地贫基因携带率地区携带率(%)地贫β地贫合计广东8.532.5411.07广西14.956.7821.73四川1.922.184.1台湾4.201.105.3香港5.023.418.43Xu,etal.JClinPathol2004,57:517-22.Cai,etal.ChiJEpidemiol2002,23:281-5.在我国，地中海贫血主要在南方广东、广西、海南、四川、重庆等省市发病率较高，以广西、广东最为严重。4遗传性血红蛋白病三大类♪地中海贫血(地贫)（Thalassemias）常见为-地贫和-地贫♪异常血红蛋白病珠蛋白结构异常，绝大部分没有或有轻度临床诊断♪遗传性持续性胎儿血红蛋白珠蛋白的合成不随着胎儿的发育而发生改变，胎儿血红蛋白持续表达。地中海贫血定义及分类地中海贫血（Thalassemia）简称地贫（Thal），是由于血红蛋白的珠蛋白肽链基因突变或缺失，使某种珠蛋白肽链合成障碍而致的一种遗传性慢性溶血性贫血。血红蛋白分子是由珠蛋白+血红素组成，珠蛋白由两对（4条）肽链构成。根据珠蛋白肽链基因（简称α基因或β基因）缺失、缺陷或基因突变和珠蛋白肽链合成障碍的不同，可将地贫分为α型、β型、δβ型和δ型四种，其中以α型和β型地贫较为常见。地中海贫血定义及分类人类血红蛋白的合成和演变胚胎期胎儿期成人gower1-ζ2ε2gower2-α2ε2Portland-ζ2γ2HbF-α2γ2HbA-α2β2HbA-α2β2HbA2-α2δ2HbF-α2γ2地贫血红蛋白的组成正常成人血红蛋白（Hb）有三种：HbA(α2β2)(2.5—3.5%)、HbA2(α2δ2)(96.5-97.5%)、HbF(α2γ2)(0-1.0%)。α地中海贫血及基因型21212212121212121血红蛋白正常轻型：2个α基因缺失或突变中间型（HbH疾病）：3个α基因缺失或突变HbBart‘s：3个α基因缺失或突变静止型：1个α缺失或突变α地中海贫血的临床特征临床特点静止型（α地贫2）轻型或标准型（α地贫1）中间型（HbH病/CS型HbH病）重型HbBart’s胎儿水肿综合征）发病年龄＜3个月儿童，成人儿童，成人胎儿贫血程度无无或轻度中度～重度重度黄疸无无轻度～中度无或轻度肝脾肿大无无或轻度轻度～中度重度血片RBC：形态异常正常轻度中度～重度重度血红蛋白电泳正常正常HbH带或伴HbBart’sHbConstantSpring大量HbBart’s伴HbPortland少量HbHHbF正常正常正常或轻度减少无HbH包涵体无无或可有强阳性阳性α/β1∶10.7～0.950.3～0.6基因诊断缺失1个或突变αα/α-，ααT/αα缺失2个或突变αα/--或αα/αT-缺失3个或突变α-/--，ααT/--缺失4个--/--α-地贫血红蛋白比较表型HbAHbBart’sHbH正常人97-98%00静止型携带者96-98%0-2%(Atbirth)0轻型地贫症状85-95%2-8%(Atbirth)2%HbH疾病下降10%(Atbirth)5-40%HbBart‘s070-80%(with20%HbPortland)0-20%β地中海贫血及基因型βGeneβGeneβGeneβGeneβGeneβGene纯合子:两个基因正常杂合子:一个正常，另一个不正常纯合子:两个基因都不正常XXXβ地中海贫血的基因型和临床类型基因型遗传型分子遗传基础临床类型临床特点Hb电泳β0/β0纯合子无β肽链合成重型重度贫血HbF99.6%β+/β+纯合子有少量β肽链合成重型或中间型取决于β基因缺失程度和α基因代偿和度HbF、HbA2β0/β+双重杂合子等位基因均有病变，β肽链合成10%重型或中间型一般重于β+/β+纯合子HbF、HbA2β0/β杂合子点突变，病变基因不成β肽链轻型无症状，偶然发现HbA2、HbFβ+/β杂合子点突变，仍可做成β肽链轻型无症状，偶然发现HbA2、HbFβ+/βE双重杂合子β肽链合成减少，βE肽链合成重型中重度贫血HbE、HbFβ+/βS双重杂合子β肽链合成减少，βS肽链合成重型中重度贫血HbE、HbF表现型HbAHbA2HbF正常正常正常正常静止型携带者正常正常正常βTHAL轻型降低正常或增加正常或增加βTHAL中间型降低正常或增加增加βTHAL重型降低通常增加增加β地中海贫血血红蛋白组成地贫的危害轻度地贫患者无特别不良反应中、重度地贫患者有贫血症状，如浑身无力、肝脾肿大等，随着年龄增长会越来越严重。重型α地贫患儿在出生24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致死产。重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年左右出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折。16地贫患者的困境4000元：重型地贫患儿平均每月需4000元的治疗费用以维持生命。成年人每月的治疗费用接近万元，每年治疗费用至少10万元，每例重症地贫患儿出生给社会和家庭带来的经济负担高达100-300万元。20岁：重型β地贫患儿需要终生输血治疗，平均存活年龄仅10岁左右，得不有效治疗的重型地贫患儿很难活到20岁。造血干细胞：根治重型地贫患儿的唯一方法移植造血干细胞。费用超过40万，且有90%的患者配对不成功。17地贫预防手段18孕前婚育指导防遗传病出生前产前筛查防先天病婴幼年期婴儿筛查提早干预成年期婚育指导杜绝患儿地贫的病因决定了它难治却可防18社会关注-世界地贫日2013年5月8日第20个“世界地贫日”中国宣传主题：地贫防控从婚前孕前开始19地贫遗传模式若夫妇二人是同一种地贫基因的携带者，那么他们每次怀孕都有1/4的概率怀有重度地贫患儿的可能。若夫妇二人确诊一方为地贫基因的携带者，而另一方完全正常，则每次怀孕，孩子有1/2几率是地贫基因携带者1/2完全正常。20筛查对象地中海贫血患者-病因诊断孕前夫妻双方-明确生育地中海贫血儿风险高危人群-已经生育地中海贫血儿的夫妻双方新生儿筛查-尽早诊断、尽早治疗孕期夫妻双方-防止生育地中海贫血儿21正常人群也需要进行地贫基因检测！全民注重优生优育；人口流动性大，地贫患者分散性高；正常人群中地贫基因携带者约占2%；22病因探究找到方法地中海贫血α点突变/缺失β地中海贫血基因轻型β－地中海贫血、中间型β－地中海贫血、重型－β海贫血遗传性胎儿血红蛋白持续症α地中海贫血基因静止型、标准型、HbH病、Bart’s胎儿水肿综合征β点突变23地贫产品介绍25通量高—每次检测可分析96个样本品质优—阴、阳性符合率均为100%时间短—报告时间最短可至5小时分型强—每个突变位点准确分型覆盖广—可覆盖中国人95%以上突变种类多—外周血、羊水、绒毛、脐带血、足血片序号基因缩写突变位点描述序号基因缩写突变位点描述1HBAWS122Codon122(C-G)13HBBCD43CD43GT2HBAQS125Codon125(T-C)14HBB-29-29AG3HBACS142Codon142(T-C)15HBBInt起始密码子ATGAGG4HBA-SEASEA缺失16HBBCD14-15CD14-15(+G)5HBA-3.73.7缺失17HBBCD27-28CD27-28(+C)6HBA-4.24.2缺失18HBB-32-32CA7HBBCD41-42CD41-42(-TCTT)19HBB-30-30TC8HBBIVS-2-654IVS-2-654CT20HBBIVS-1-1IVS-1-1GT9HBBCD17CD17AT21HBBIVS-1-5IVS-1-5GC10HBB-28-28AG22HBBCD31CD31(-C)11HBBCD26CD26GA23HBBCapCAP+40-+43(-AAAC)12HBBCD71-72CD71-72(+A)\\\\本试剂盒适用于人DNA样本的地中海贫血基因型（包含3种α突变、3种α缺失及17种β突变）中国常见的突变基因型的检测，可用于人地中海贫血的辅助诊断及适用于大样本量的携带者筛查和产前基因诊断。覆盖广26品质优点突变与测序结果符合率高达100%三家临床医院广东省妇幼保健院、广西省妇幼保健院及湖北省妇幼保健院结果汇总见下表：阳性符合率（临床灵敏度）=711/（711+0）=100%；阴性符合率（临床特异性）=709/（0+709）=100%；总符合率=（711+709）/（711+0+0+709）=100%；27检测方法阳性样品阴性样品α点突变β点突变现代高达试剂盒260478573测序260478573共计738573检测方法阳性样品阴性样品现代高达试剂盒428217Gap-PCR428217品质优缺失突变与Gap-PCR结果符合率高达100%阳性符合率（临床灵敏度）=428/（428+0）=100%；阴性符合率（临床特异性）=217/（0+217）=100%；总符合率=（428+217）/（428+0+0+217）=100%；时间短检测流程样本核酸提取20min多重PCR扩增2.5hr液相杂交15min结果检测与判读1min/test29分型强全新液相芯片技术简介二维数字编码磁珠30藻分型强全新液相芯片技术简介目前，国内地贫分子诊断方法主要有Gap-PCR、反向斑点杂交、导流杂交、测序等。其中Gap-PCR只能检测出α地贫中的缺失型，反向斑点杂交需要两次检测才能完整的检出α、β-地贫；导流杂交技术不能做到基因位点的准确分型；而测序方法需要昂贵的仪器，复杂序列分析，人工经验要求高，不利于大规模筛查。国内现有地中海贫血基因检测技术及现状α-地中海贫血β-地中海贫血亚能生物技术(深圳)有限公司α-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)(国食药监械(准)字2012第3401088号β-地中海贫血基因检测试剂盒(反向点杂交法)(国食药监械(准)字2013第3400676号中山大学达安基因股份有限公司α-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)(国食药监械(准)字2011第3401628号β-地中海贫血基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)(国食药监械(准)字2012第3401665号珠海经济特区海泰生物制药有限公司东南亚型α-地中海贫血Zeta链蛋白检测试剂盒(酶联免疫法)(国食药监械(准)字2011第3400228号深圳益生堂生物企业有限公司β地中海贫血基因检测试剂盒(PCR探针法)(国食药监械(准)字2012第3400354号厦门致善生物科技有限公司β-地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)(国食药监械(准)字2013第3401294号潮州凯普生物化学有限公司α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+膜杂交法)(国食药监械(准)字2012第3400399号北京现代高达生物技术有限责任公司α-和β-型地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-杂交法)(国食药监械(准)字2013第3401572号地中海贫血检测试剂盒现代高达同类产品（Gap-PCR、膜杂交）样本收集样本收集基因组DNA获取基因组DNA获取缺失和突变分2管进行PCR扩增α缺失，α点突变和β点突变分别进行PCR扩增多重微珠杂交（30min）Gap-PCR核酸电泳（1h）膜杂交（2-4h）自动化洗涤（5min）人工洗涤（膜杂交）电脑软件自动判读人工判断，UV下观察α缺失突变人工判读，2张膜条分别对α和β进行判读同类产品操作流程对比比较内容现代高达同类产品（Gap-PCR、膜杂交）检测位点同时对α缺失、α突变及β突变检测分别对α缺失、α突变及β突变检测基因分型可以准确区分杂合和纯合型只能区分少数位点结果分析仪器自动分析判断人工分析判读，耗时耗力报告时间1天4-7天（96个样品）分析通量96样本/次，适合大样本量检测单个样