新一代测序技术的原理

Next-generationsequencingtechnologyoverviewAgenda•测序技术简史•第一代测序技术•第二代测序技术•第三代测序技术1测序技术简史1950196019701980199020002010DevelopmentofSangerSequencing(1977)InventionofAutomatedFluorescentSequencer(1985)InventionofCapillarySequencer(1996)InventionofAppliedBiosystemsSolidSystem(2007)InventionofIlluminaGenomeAnalyzerSystem(2006)Inventionof454GS20Sequencer(2005)chemicaldegradationmethodbyMaxam-Gilbertmethod(1977)ChemicaldegradationmethodbyWhitfield(1954)InventionofHeliscopesinglemolecularsequencerInventionofSinglemoleculerealtime(SMRT)DNAsequencingInventionofNanoporesinglemolecularsequencing(OxfordNanoporecorporation)InventionofpersonalgenomemachineInventionofopticalmappingsystem1977年，英国人FredSanger发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）（H）ONHHOHHOHHCH2OPOOHOONHHOHHHCH2OPOHOOH（H）5´磷酸3´羟基3´,5´-磷酸二酯键核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示意图核酸序列形成的基础“双脱氧末端终止”的含义TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA终止物标记方法因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。3730xlSequenceMap200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms454测序原理测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，在每一轮测序反应中，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入，每次只进入一个碱基。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。通过检测荧光信号释放的有无和强度，确定被测分子的序列。光信号由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰的高度（光信号）与反应中掺入的核苷酸数目成正比。反应结束后，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。454测序流程1.待测DNA文库的构建将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后继的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段AA被洗脱掉，片段AB\BA\BB结合到磁珠上，通过变性处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。2.EmulsionPCR将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28μm的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增,扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。3.测序将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中进行测序。PTP板上含有很多直径约为44μm的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下的测序反应。454的特点较高的测序通量，每个循环能产生总量为400-600Mb的序列。提高测序读长，长度达到400bp，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。因此454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatformsn=degeneratebasesz=universalbasesSOLiD的特点•通量大•成本低•序列短–Ligase的方式虽然能一定程度避免phasing/pre-phasing，但增加的复杂度也降低了效率•灵活性差，对小数据量测序不适用•Two-basecoding200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms2Hiseq2000（Solexa）测序原理Solexa是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实现在小型芯片(FlowCell)上进行桥式PCR反应。由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。可逆阻断技术CTAGCTA5’-3’-…-5’GT合成第一个碱基Cycle1:按顺序加入反应试剂清除未反应的碱基和试剂激发碱基荧光并收集荧光信号去除阻断基团和荧光基团Cycle2-n:重复前面的步骤GTCTAGTCTGCTAGA3Hiseq2000测序技术流程制备芯片模板杂交桥式PCR扩增测序引物准备测序2测序测序生成basecalls3数据分析拍照图片IntensitiesReadsAlignments4DNA打断末端修复加A加接头纯化文库制备13.1文库制备Solexa有三种不同的测序种类：Single-ReadSequencing单向测序Paired-EndSequencing双向测序IndexedSequencing混合样品测序这三种测序类型的文库构建大体一致，主要区别在于接头。Single-ReadSequencingFragmentDNA5’3’5’+3’5’5’+5’3’3’5’1.EndrepairT4polymerase,DNAPol1(Klenowfragment)3’5’po4po45’3’PhosphorylationT4polynucleaotidekinase,ATP3.Ligationofadaptors3’Apo45’A3’5’po42.Add3’AdenosinewithKlenow(3’exo-)anddATP+DNAinsert5’5’3’3’SBSoligoP7反向互补序列3’T5’po43’5’SBSoligoP7反向互补序列PCRenrichment5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’3’3’1stroundPCRP7P5SBSoligoP7反向互补序列P73’PCRenrichment(cont.)5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’2ndroundPCRInsertP7P5SBSoligoP7反向互补序列P5ClustertemplateSBSoligoP7Paired-EndSequencing双向测序IndexedSequencing混合样品测序3.2芯片制备和测序•Cluster生成步骤:–固定–扩增–线性化–阻断–引物杂交Cluster生成化学步骤cBOT进样孔出样孔•Single-ReadSequencing(SR,单向测序)OHFlowCell接头diolP7P5dioldiol模板杂交dioldiol延长dioldiol变性dioldiol1stcycle变性1stcycle退火dioldiol1stcycle延长dioldioldioldiol2ndcycle变性2ndcycle退火dioldioldioldioldioldiol2ndcycle延长n=35总数线性化OH用ddNTP()阻断Cluster扩增完成OHdioldiolOHPrimer加测序引物OHNaIO4YX123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…3.3测序•Paired-EndSequencing(PE,双向测序)和IndexedSequencingSingleReadPairedEndTemplateHybridization模板杂交UUOHOHGraftedflowcell芯片上的接头UP7P5Initialextension第一链的延长UUDenaturation变性UU1stcycledenaturation变性n=25totalUU1stcycleannealing退火UU1stcycleextension延长UU2ndcycledenaturation再变性UU2ndcycleannealing退火UUU2ndcycleextension延长UUUClusterAmplification扩增后的簇UUP5Linearization(USER)线性化BlockwithddNTPs阻断Primer加测序引物SBS进行测序SequencingFirstRead第一端测序DenaturationandDe-Phosphorylation(PNK)变性与去磷酸化OHOHResynthesisofP5Strand合成OHP7Linearization(fpg)线性化OHBlockwithddNTPs阻断Primer加测序引物SequencingSecondRead第二端测序Theadvantageanddisadvantageofthreeplatform第三代测序技术单分子测序技术HeliscopePacificBiosciencesLifeTechnologiesIonTorrentOxfordNanopore基因组光图谱系统谢谢！谢谢观赏！