胚胎冷冻保存

胚胎冷冻保存将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。胚胎冷冻保存的基本概念胚胎冷冻保存的意义•胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率；•长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；•便于国际间交流；•替代种畜引种。⑴渗透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO等，防止溶质效应。⑵非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。基础液：mPBS（改良）、TCM-199、PBS、HEPES等，最常用mPBS。抗冻剂的种类及作用特点：分子量小于100，易于渗透特点：分子量大，不进入细胞玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。玻璃化溶液（VS）：•细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。•细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。抗冻剂的种类及作用⑴结晶变化：温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。⑵溶质效应：降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。⑶机械效应：降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚胎造成致命的机械损伤。胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤⑴常规冷冻法：“植冰”后控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。⑵超速冷冻法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。⑶玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。胚胎冷冻保存方法•历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功；1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。•操作流程：（1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。常规冷冻法（2）植冰（诱发结冰）：植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法诱发结冰。常规冷冻法（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓慢降温。•以0.33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮；•以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮；•以0.5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。常规冷冻法（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室温或37℃水浴中解冻。（5）除去抗冻剂：原因：解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。抗冻液：蔗糖溶液；操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液，进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。常规冷冻法•从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中:1.5M乙二醇+蔗糖+PBS+AA+FCS•装入细管(编号预先准备好)•放入冷冻容器-6.0℃•Seedingice•每分钟降低0.5℃，一直到-30℃为止•放入液氮容器常规冷冻程序玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。玻璃化溶液（VS）：•细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。•细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。胚胎玻璃化冷冻几种常见的玻璃化冷冻方法：（1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。胚胎玻璃化冷冻（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法：主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)；玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25％混合而成(PG25)，两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透过性抗冻剂。方法：室温下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中冷冻保存。（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法：抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶液；方法：室温胚胎在EFS玻璃化溶液中2～5分钟平衡后，即投入液氮。胚胎玻璃化冷冻（2）Zhu等玻璃化冷冻保存法：主体抗冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜；玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS；方法：室温下，将胚胎在10％乙二醇或10％甘油或10％乙二醇＋10％二甲基亚砜中平衡5分钟，再移入EFS或GFS或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒钟，即两步法冷冻保存。此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆可进行冷冻保存。胚胎玻璃化冷冻胚胎细管编号E546-SM4567891%2223333M198Mar,27胚胎公司冷冻编号配种编号供体母牛登记公牛登记冷冻日期直接移植胚胎号胚胎发育阶段胚胎质量BetsyDT1胚胎细管编号胚胎装管保护细胞膜免受损害；保护胚胎细胞，免受晶体损害；具有“渗透活性”；解冻后保护剂必须从细胞内去掉；甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉；乙二醇：直接胚胎移植方法,通过细胞膜快速扩散，因而不需要慢慢去掉。冷冻保存的要点胚胎解冻解冻方法：•慢速解冻：以4-25℃/min的速率使胚胎由冷冻保存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当温度由-196℃升到-50～-15℃埋，细胞内仍可能形成大冰晶而致死胚胎。•快速解冻：温水浴法，以300-360℃/min的速率使胚胎在30-40s内从-196℃至室温。胚胎解冻脱除保护剂：目的：防止保护剂对胚胎的毒性；防止因细胞内保护剂浓度过高，导致胞内外渗透压差过大，而使胞外水分内流，最终使胚胎过度膨胀受损。•经典方法：浓度递减的保护液逐步稀释脱除，繁琐费时，但有效；•蔗糖等非渗透性保护液逐步脱除，使用较多；