《分子诊断》PCR

聚合酶链反应及其应用检验医学院周兰[e-mail]分子诊断学重医医学学士（1979年，临床医学）重医医学硕士（1986年，病理生理学）重医医学博士（1994年，临床检验诊断学）芝加哥大学博后（00-03年，分子肿瘤实验室）电子邮箱[e-mail]检验医学院周兰本讲内容1PCR概述2PCR原理3PCR产物检测与分析方法4PCR特点及应用5PCR技术发展简史6PCR衍生技术7荧光定量PCR8其它基因扩增检验技术9PCR相关检验的质量管理1-1基因扩增及其方式geneamplificationgenemagnification1PCR（Polymerasechainreaction）概述1-1基因扩增1）定义：指基因拷贝数增加的现象是基因表达增加的一种重要机制一般说来正常细胞中，特定基因的扩增与其对内外环境因素的应激反应有关病变细胞中，基因扩增则是致病因素所致的异常扩增,如肿瘤细胞中常见癌基因的扩增2）方式？？？2）基因扩增的方式（1）天然扩增---机体细胞内的扩增在各种因素（发育和进化的需要、对环境刺激的应答等）作用下，机体细胞内相关基因的复制扩增（2）人为扩增①分子克隆----体外、细胞内②DNA合成仪---试管内（无细胞体系）③PCR---------试管内（无细胞体系）重组DNA目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取目的DNA分子1）基础研究的需要*医学生命科学研究*农林畜牧鱼业的基础研究……2）应用研究及应用的需要*医学领域（如基因诊断、法医学检测）*现代生物技术产业（药物开发，疫苗，高质量食品和日常生活用品等）……1-2PCR技术诞生所依赖的社会需求1-3PCR的定义模板DNA引物（引子序列，一对）耐热DNA聚合酶四种单核苷酸Mg2+PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始一个分子DNA变成两个分子PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束两分子DNA变成4分子DNA利用DNA聚合酶催化一对引物间的特定DNA片段在体外实现快速、大量扩增的方法也称：无细胞克隆技术或：特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术，是基因扩增技术的一次重大革新1-3PCR定义现已广泛应用到分子生物学研究、临床检测等各个领域。优点：特异、敏感、简便自动化快速、高效（数小时内可使模板扩增107～108倍）2-1DNA的变性和复性2-2PCR标准反应体系及反应过程--三步曲2-3反应的结果2-4PCR的反应条件及其对PCR的影响2-5产物片段及其累积过程2PCR原理2-1DNA的变性与复性DNA的变性（denaturation)热变性是实验室最常用的方法DNA的复性（renaturation)1）标准反应体系（五要素）（1）DNA模板(template)：靶基因（2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）（3）催化酶：耐高温的DNA聚合酶（如：Taq酶）（4）一对引物（primer）：扩增序列的决定者其与靶基因两侧序列互补（5）Mg2+和Buffer2-2PCR标准反应体系及反应过程高温变性：在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板低温退火：在低温（37～55℃）下，两条人工合成的寡核苷酸引物分别与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链适温延伸：在耐热DNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物的3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链2）反应过程----三步曲1234522557294时间（min）温度（℃）2）PCR的反应过程适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR原理示意图SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension2-2反应过程播放PCR短片1）每一条双链DNA模板，在一次热循环后就成了两条双链DNA分子2）每次循环产生的DNA均能成为下次循环的模板3）每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物以指数形式（2n）迅速扩增4）经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上实际上一般可达106～107倍（why？？？）2-3PCR的结果式中：Y表示扩增产物的量A表示n-1次扩增时DNA分子数量E表示扩增效率n表示循环次数扩增30个循环，即n=30时若E=100%，则y=230=1073741824(109)若E=80%，则y=1.830=45517159.6(107)由此可见，其扩增的倍数是巨大的!PCR反应动力学公式：Y=A（1+E）n2-3PCR的结果30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭（EB)等染色，在紫外灯照射下可见到DNA的特异扩增区带是一种荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出红色荧光根据情况，可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB；有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15minEB染色后，肉眼可见核酸电泳带的DNA量一般5ng它是一种高诱变性的化学物质SYBR-green和gelred是毒性更小的染料溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)2-4PCR的反应条件及其对PCR的影响PCR操作程序①向一微量离心管中依次加入双蒸水、缓冲液、Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和TaqDNA聚合酶②混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底③加矿物油50～100μl于反应液表面，防蒸发④置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）1）模板：**单、双链均可**几乎不需要纯化**但，必须了解靶基因两侧的核酸序列**一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞或裂解病原体，再消化除去染色体的蛋白质以游离靶基因，便可直接用于PCR扩增**RNA模板提取时，要防止RNase降解RNA注意：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类—微生物—细胞：血痕、精斑、口腔拭子、阴道拭子、尿样、单根毛发、指甲削刮的碎屑、牙刷、琥珀中的昆虫、木乃伊—固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化模板DNA的浓度：0.1～2ug/100ul体系*PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高*但，模板DNA浓度过高，则致非特异性产物增加模板DNA的来源2）耐热的DNA聚合酶来自嗜热水生菌，耐热具有5’-3’方向的聚合酶活性5’-3’外切酶活性逆转录酶活性酶量增加：降低反应的特异性酶量过少：降低反应的产量来源：有提纯产物也有基因工程产品例：经典的TaqDNA聚合酶的特性该基因2496bp（832aa），酶蛋白为94KDa酶催化反应速度与温度的关系75～80℃：延伸约150nt/酶分子/s70℃:延伸60nt/酶分子/s55℃:延伸24nt/酶分子/s温度过高(90℃以上)过低(22℃以下)都降低TaqDNA酶活性良好的热稳定性：PCR混合物中的TaqDNA聚合酶92.5℃X130min95℃X40min97.5℃X5～6min其热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件也是PCR技术能迅速发展和广泛应用的重要基础仍可保持50%的活性例：经典的TaqDNA聚合酶的特性忠实性该酶无3’→5’外切活性SO,在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶无法予以校正即其保真性不如PfuDNA聚合酶等其碱基错配机率：2.1×10-4例：经典的TaqDNA聚合酶的特性离子依赖性Taq酶依赖Mg2+，对[Mg2+]非常敏感**以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行PCR反应10min，发现：[MgCl2]在2.0mmol/L时TaqDNA聚合酶的活性最高**Mg2+过高：抑制酶活性[Mg2+]在10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性例：经典的TaqDNA聚合酶的特性TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链的3’端加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3’突出的单A核苷酸尾另一方面，在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3’端加入单T核苷酸尾，产生3’端突出的单T核苷酸尾应用该特性，可实现PCR产物的T-A克隆法除经典的Taq酶外，还陆续发现下列耐热酶1）TthDNA聚合酶：**从ThermusthermophilusHB8中提取而得**该酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA**当再加入Mg2+后，该酶的聚合活性大大增加SO，逆转录为cDNA与DNA的扩增可用同一种酶催化即该酶适用于RT-PCR2）pfuDNA聚合酶是从Pyrococcusfuriosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5’-3’外切酶活性，但具有3’-5’外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低，催化DNA的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍PCR产物为平端（无3’端突出的单A核苷酸）3）VentDNA聚合酶*是从Litoralis栖热球菌中分离出的*不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能*可扩增12kb的模板DNA对PCR所用的聚合酶的选择原则和参考信息（自学，了解）TaKaRaPCREnzymes1.TaKaRaTaqTM1）用于1～2kbp以下的DNA片段的PCR扩增2）比较经济的PCR用DNA聚合酶3）适用于一般的PCR扩增或检测2.TaKaRaExTaqTM1）用于15kbp以下的DNA片段的PCR扩增2）融合了LA-PCR技术3）可信度是TaKaRaTaqTM的3～4倍4）从扩增灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性考虑，是一种万能型PCR用DNA聚合酶3.TaKaRaLATaqTM1）用于10kbp以上的DNA片段的PCR扩增2）融合了LAPCR技术3）可信度是TaKaRaTaqTM的7倍4）适于扩增富含GC或复杂二级结构的DNA（用GCBuffer）4.PyrobestTMDNAPolymerase1）高保真性（HighFidelity）：与Pfu、VentDNA聚合酶相同，可信度是TaKaRaTaqTM的10倍以上2）良好的扩增性能：与TaKaRaTaqTM有相同的扩增性能（优于Pfu、VentDNA聚合酶）TaKaRaPCREnzym