分子生物学 第二章

第二章生物信息的传递生物信息的传递DNA间的传递DNA的复制DNA到RNA的传递转录与剪接RNA到蛋白质间的传递蛋白翻译与转运细胞信号传递第一节DNA复制生命延续的奥秘--DNA复制拓扑结构问题1953年，Watson&Crick提出DNA双螺旋结构同年，提出复制的可能方式：两条母链均可作为模板来合成新的DNA链半保留复制DNA双螺旋结构的难题—拓扑结构问题：复制时两条链如何打开？复制方式的假说弥散式复制半保留复制全保留复制半保留复制的实验证明—Meselson-Stahl实验在含有15NH4Cl的培养基中培养大肠杆菌将细菌转移到正常培养基（含14NH4Cl）分别于细菌分裂一次和两次后取样，密度梯度离心复制方式的确定拓扑异构酶—解旋酶解决了拓扑问题催化断裂-再连接反应的酶。在DNA分子一条或两条链上形成切口，通过切口解开螺旋。复制DNA的复制发生在细胞周期的S期起始延伸终止复制起始—双向复制真核和原核基因组中形成两个复制叉（复制眼），分别以一条链为模板，双向复制每条链复制中，DNA合成方向相同：5’到3’两条链复制行进的方向相反大肠杆菌复制起点复制起点oriC，长约254bp2个重复基序1）9核苷酸5拷贝DnaA蛋白结合位点结合30个DnaA2）13核苷酸3拷贝富含AT几个解旋相关蛋白DnaA,HU,DnaCDnaB解旋酶酵母复制起点自主复制序列ARS，不足200bp含四个具相似序列的亚结构域：A1+B1起始识别序列约40bp，为起始识别复合物（ORC)结合部位B2+B3与大肠杆菌复制起点相似结合ARS结合因子（ABF1)复制延伸在复制起点形成复制叉母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后链（半不连续）DNA聚合酶引物参与DNA复制的DNA聚合酶细菌5个，其中DNA聚合酶III是复制酶真核生物9个，其中DNA聚合酶δ是复制酶后滞链非连续合成合成方向同前导链：5’到3’最初形成一些短的片段，称冈崎片段引物与引发酶RNA引物引发酶合成8-12bp的引物引发酶不是转录酶大肠杆菌复制需要多种蛋白的协作拓扑异构酶、解旋酶(DnaB)：解旋复制酶：复制引发酶；提供引物单链结合蛋白（SSB)：稳定打开的双链连接酶：连接冈崎片段其它蛋白大肠杆菌DNA复制终止存在终止序列：Tus蛋白识别位点Tus蛋白的不同结合方向控制了复制叉是否能够通过DNA复制的特点半保留复制---DNA的两条单链分别作为模板复制与之互补的单链;DNA的复制具有方向性,只能从5’→3’;DNA的两条单链的复制是非对称性的,3’链为连续复制,5’链为间断复制;DNA的复制必需先在复制起始点合成一段引物.第二节转录与剪接细菌的转录调控转录起始1）组成型控制：依赖于启动子结构2）调节型控制：操纵子学说，依赖于调解蛋白水平转录合成1）延伸阶段2）终止阶段无转录后加工细菌RNA聚合酶结构：核心酶+σ亚基1）核心酶：α2ββ’2）σ亚基：启动子特异性结合细菌启动子结构决定转录的基础水平细菌启动子共有序列是可变的1）-10框：T80A95T45A60A50T96影响启动子复合物从封闭向开放的转换2）-35框：T82T84G78A65C54A45影响σ亚基识别，从而影响RNA聚合酶结合转录起始点附近及转录单位前50个核苷酸序列影响转录起始后的延伸不同的基因可能有不同的最有效启动子启动子序列突变可能改变转录起始的基础水平不同的σ亚基识别不同的启动子σ70：标准σ亚基，指导大多数基因转录特定条件下其它σ亚基被激活非标准的σ亚基和其识别序列操纵子及其相关概念操纵子(operon)，指一组在基因组中彼此相邻的基因，两基因头尾间可能仅隔一两个核苷酸。操纵子的所有基因都作为一个单位表达。结构基因(structuralgene)，编码非调控因子的基因。调控基因(regulatorgene)，编码调控蛋白（阻抑物）的基因。阻抑物(repressor)，能阻止基因表达的蛋白质，可与操纵基因结合来阻止转录。操纵基因(operator)，位于启动子下游可与阻抑物结合的DNA元件，当与阻抑物结合后调节启动子抑制转录，常为回文序列。诱导物(inducer)，通过与阻抑物结合激活基因转录的小分子物质。乳糖操纵子操纵子：lacI;lacZ+Y+A结构基因:lacZ+Y+A调控基因:lacI阻抑物:lacI编码蛋白操纵基因:O启动子：P调控物：异乳糖乳糖操纵子的调控辅阻抑物与色氨酸操纵子辅阻抑物(co-repressor)，结合到阻抑物上来抑制转录的小分子。转录的延伸阶段：转录泡的形成转录中RNA聚合酶将两条DNA链暂时分开，形成转录泡，接着使用其中的一条联作为模板，指导合成互补的RNA。转录泡的长度是12-14bp，其中RNA-DNA杂合链的长度是8-9bp。转录的终止--两种终止子（1）内源性(固有性)终止子(intrinsicterminator)，在体外没有任何其它因子的参与时，仍能终止转录的某些位点。特征：1）反向回文序列转录后形成发夹结构，在发夹的基部有GC富含区；2）转录单元最末端连续6个U残基。ρ-依赖性终止子(Rhodependentterminator)，需要ρ因子辅助。特征：1）形成发夹不如内源性终止子牢固，但可以使RNA聚合酶暂停；2）ρ因子有解旋酶活性，当RNA聚合酶暂停时，它跟上并打开RNA-DNA碱基配对，释放出转录物，终止转录。转录的终止--两种终止子（2）延伸和终止的调控抗终止，抗终止蛋白结合到操纵子起始处附近的抗终止位点上，再与RNA聚合酶结合，使RNA聚合酶通过终止信号继续转录。衰减作用，出现在与氨基酸的生物合成相关的酶的操纵子，如色氨酸操纵子中。抗终止色氨酸操纵子的衰减作用色氨酸操纵子的衰减作用转录起始点与trpE基因间可形成两个发夹：其中小的为终止信号，而大的更靠近起始点也更稳定；两发夹环位置重叠，一次只能形成一个；RNA聚合酶与RNA转录物5’端核糖体间相对位置决定形成哪一个发夹环：若核糖体暂停，形成大发夹，继续转录，并随即翻译成蛋白；核糖体随RNA聚合酶移动，会占据形成大发夹环茎部的位置，只能形成小发夹，终止转录。色氨酸的量可调节大小发夹环的形成；终止信号上游有一个可编码14个氨基酸（内含两个色氨酸）的短ORF，色氨酸不足时蛋白质合成停止，核糖体暂停，则聚合酶继续转录，反之则终止。真核细胞转录起始调控转录起始1）激活物2）阻抑物转录合成1）启动子清除、脱离与加帽反应2）延伸因子3）合成终止与多聚腺苷酸化转录后加工：内含子剪接激活物(activator)激活转录起始的蛋白质可能结合于启动子区域，影响单个基因的转录，也可能结合于增强子区域，影响多个基因的转录可与前起始复合物相互作用，作用的部位称为激活域(activationdomain)。激活域的常见结构包括：1）酸性结构域，富含Asp和Glu2）富含Gln的结构域3）富含Pro的结构域阻抑物对于真核生物转录起始，激活物是主体，阻抑物相对较少大多结合于上游启动子或沉默子根据所处环境不同，一些蛋白可能既有激活作用又有阻抑作用，如NC2对于有TATA框的启动子起抑制作用，而对无TATA框的启动子有激活作用阻抑物可能与前起始复合物相互作用真核转录真核与原核RNA聚合酶具有结构上的相似性真核转录的三个结构特征：1）5’端加帽2）3’端加尾3）内含子剪接合成与加工同时延伸因子的存在启动子清除、脱离与加帽反应启动子清除，前起始复合物向开始合成的复合体过渡启动子脱离，聚合酶离开启动子，形成转录物加帽发生于转录物达30bp前。加帽反应加一个G到5’端—鸟苷酸转移酶G甲基化---鸟嘌呤甲基转移酶帽子结构在不同生物中甲基化程度不同。延伸因子真核转录物更长，需要延伸因子来帮助聚合酶以保持转录复合物稳定合成终止与加尾反应Poly(A)聚合酶是加尾酶3’端内部切断，再加尾加尾信号AATAAA,位于加尾处上游10-30bp切割处为CA，其后有富含GU区辅助因子：CPSF与CstF加尾与终止同时内含子剪接内含子类型GU-AG内含子的保守剪接位点序列内含子剪接途径：套索结构剪接装置的中心是细胞核小RNA(snRNA)选择性剪接内含子类型GU-AG内含子的保守剪接位点序列剪接位点：外显子—内含子交界处序列5’端含GU：5’-AG↓GUAAGU-3’(供体位点)3’端含AG：5’-PyPyPyPyPyPyNCAG↓-3’(受体位点,Py：C或U)内含子剪接途径—套索结构分支位点，内含子内部的含A位点，序列在酵母中完全保守为：5’-UACUAAC-3’，在动物中为5’-PyNPyPyPuAPy-3’5’剪接位点被剪开，内含子5’端连接到分支位点A的2’位置，形成套索3’剪接位点被剪开，内含子以套索形式释放，左右外显子相连剪接装置的中心是细胞核小RNA(snRNA)剪接装置/剪接体，参与剪接的非mRNA装置，包括核小核糖核蛋白snRNP(snRNA+蛋白)和其他相关蛋白。中心组分：五种snRNA(U1、2、4、5、6)待命复合体：起始剪接。U1+SF1等前剪接复合物：与分支位点结合。待命+U2剪接体：3’剪接点套索。前剪接+U4/5/6选择性剪接使转录组和蛋白质组比基因组更复杂第三节蛋白质合成蛋白质合成三种RNA1)mRNA：密码子，指导蛋白质合成2)tRNA：反密码子，识别并转运氨基酸3)rRNA：核糖体的主要成分三个过程1)翻译的起始2)肽链的延伸3)翻译的终止mRNA与密码子mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的1个氨基酸，称为密码子(codon)。密码子特性连续性：一个接一个兼并性：多个密码子对应某一个氨基酸同义密码子通用性：多物种通用、多细胞通用、多基因通用特殊密码子起始密码子(AUG)，也编码甲硫氨酸(Met)终止密码子(UAA,UAG,UGA)tRNA与反密码子tRNA三叶草结构受体臂连接氨基酸(氨酰化)反密码子臂与mRNA配对密码子—反密码子相互作用特异性密码子与反密码子配对摆动性密码子第三个核苷酸与反密码子第一个核苷酸配对不严格1)G-U配对2)反密码子中第1位的次黄嘌呤(I)可与A、C、U配对rRNA与核糖体核糖体是把氨基酸组装成蛋白质的工厂rRNA是核糖体的主要成分之一核糖体可以解离成大小两个亚基核糖体有三个tRNA结合位点A位点：新到来的氨酰tRNA结合位点P位点：肽酰tRNA结合位点E位点：去氨酰tRNA释放位点所以tRNA在核糖体中的移动顺序是A到P到E（与mRNA方向相同）。翻译因子参与了蛋白质的合成起始因子：细菌IF；真核eIF延伸因子：细菌EF;真核eEF释放因子：细菌RF；真核eRF核糖体再循环因子：细菌RRF翻译起始细菌和真核生物翻译方式上的主要差别阶段细菌：翻译起始复合体直接建立在起始密码子上mRNA序列上有核糖体结合位点真核：间接定位起始位点需要帽子结构和polyA尾介导细菌SD序列细菌mRNA中核糖体结合位点，与核糖体16SrRNA结合位于起始密码子上游3-10核苷酸之间细菌翻译起始真核生物翻译起始前起始复合体组装前起始复合体：40S亚基+起始tRNA+起始因子帽结合复合体（起始因子）使前起始复合体结合于mRNA5’端polyA结合蛋白（PAB)与帽结合复合体一起时前起始复合体结合于mRNA5’端真核生物翻译起始翻译延伸氨酰tRNA结合到A位（氨酰tRNA*EF-Tu*GTP复合体)与P位氨基酸形成肽键易位（EF-G*GTP)脱酰化tRNA，EF-G，GDP释放翻译终止终止反应本身需要从最后一个肽酰-tRNA上释放肽链终止后反应需要释放tRNA和mRNA，并解聚核糖体第三节蛋白质的加工与命运蛋白质加工折叠，需要分子伴侣水解，蛋白酶前肽的剪切信号肽切除多蛋白水解加工