现代分子生物学实验重点

现代分子生物学实验考试复习重点一．判断题1.Maker(分子量标准)在DNA电泳中起荧光染料（对照）的作用。（错）2.用作DNA片段克隆的载体除质粒外，还有噬菌体和人工染色体等。（对）3.PCR扩增的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。（对）4.碱变性发提取质粒是根据碱性条件下染色体DNA不变性（变性）而质粒DNA变性（不变性）的原理。（错）5.基因工程中常用的限制性内切酶可对DNA进行特异性的识别和切割。（对）6.用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般为限制-修饰系统缺陷的变异株。操作中需要无菌、低温且动作要轻柔。（对）7.大肠杆菌转化过程中，细菌在LB液体培养基中进行恢复培养时，（不）应添加相应的抗生素。（错）8、转化中的蓝白颜色筛选，在LB固体培养基的平皿中添加IPTG的作用是作为β-半乳糖苷酶作用的底物（诱导）。（错）X-Gal为生色底物。9.CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可破坏细胞膜，当低离子强度的溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不（可以）能沉淀核酸，因此将核酸与蛋白质等细胞内容物分开。（错）高离子强度的溶液不能沉淀核酸。10.一般可以用异丙醇和乙醇沉淀DNA和RNA。（对）二．问答1.PCR实验原理：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~106~7个拷贝。2.大肠杆菌感受态的制备（CaClCaCl22法法）⑴实验原理：用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。⑵注意事项：①感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。②为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。③尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。3.蓝白斑筛选原理：蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多质粒载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，β-半乳糖苷酶基因（lacZ）基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。4.碱性SDS法提取质粒实验原理：质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。5.已知一段基因序列，完成该基因的克隆。①提取该基因组中的DNA，务必保证DNA的浓度和结构的完整性。②以目的基因为基础设计上下游引物，注意引物设计的原则，保证高度的特异性。③以基因组DNA为模板，取适量引物，模板，加入Taq酶，dNTP,Mg离子，buffer进行PCR反应，注意循环次数及退火温度的准确性等。④PCR产物进行电泳分析，依据已知序列大小判断PCR结果是否正确之后进行目的DNA片段的凝胶回收。⑤回收的目的DNA与适当载体进行DNA片段的连接，制备感受态细胞后，将连接的片段导入感受态细胞用蓝白斑筛选法进行重组子筛选，对筛选所得到的目的DNA扩大培养。⑥用碱法提取质粒，酶切，琼脂糖凝胶电泳分离DNA，扩大培养在提取质粒，送至测序公司测序。⑦测序结果与已知序列相同，则该基因片段克隆完成。可保留阳性菌株扩大培养，提取质粒，即可大量克隆该目的基因。6.Trizol试剂快速提取植物总RNA实验原理：RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。Trizol方法得到的总RNA可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA,体外翻译和分子克隆等。7.CTAB法提取植物基因组DNA实验原理：CTAB，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。本实验中利用CTAB破坏细胞膜，使DNA释放出来。在高盐溶液中CTAB与蛋白质和多醣形成复合物后，通过有机溶剂抽提去除蛋白质，多糖，酚类等杂质，最后加入异丙醇即可使DNA分离出来。备用补充实验一聚合酶链式反应（PCR）技术1PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。2ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。3dNTP:反应体系中达100μM～200μM。4Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基，浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。5引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回文序列；引物３’端不能互补。6Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。7变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。8复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。9延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。10引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。实验琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（DNA）一实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。1溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。2上样缓冲液（loadingbuffer）:电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。其作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。3Marker作用：DNA标记二注意事项1EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。2实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能污染。3要有阴阳对照4加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。5每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。6应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。7电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分钟。8判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。实验二凝胶回收DNA片段原理：利用DNA凝胶纯化回收试剂盒（离心柱型）进行DNA纯化回收。在低pH高盐情况下，DNA片断选择性地吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤去除杂质，最后低盐，高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。实验三DNA片段的连接原理：外源DNA与载体分子连接的过程是DNA重组过程，重新组合的DNA称为重组体或重组子。DNA连接反应的关键酶是DNA连接酶。T4DNA连接酶是基因工程常用的连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的。利用T4DNA连接酶进行外源DNA片段和载体的体外连接反应的本质就是在双链DNA的5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的磷酸二酯键将两个DNA片段连接起来，需ATP作辅酶。本实验利用T4DNA连接酶，在还有Mg2+、ATP的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接，再将连接产物转化宿主细胞，然后对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。实验四转化及重组子的筛选一实验原理1转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。1氨苄青霉素：连接产物的T载体中含有抗氨苄的基因，若目的基因转入载体加入氨苄后可以成活。2X-Gal：生色底物IPTG：诱导实验五碱性SDS法提取质粒1载体的种类质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等。2SolutionⅠ：重悬菌体，保护DNA3葡萄糖：提高粘度，减少机械剪切4Tris.·Cl：提供弱碱性环境5EDTA：提供弱碱性环境，螯合了Mg离子抑制DNA酶的作用6SolutionⅡ：使溶液变清凉7NaOH:破坏细胞同时使DNA变性8SDS:破坏细胞膜9SolutionⅢ：中和强碱10KAc：提供一价阳离子K离子，DNA复性时需要11胰RNA酶：去除RNA酶酶活性12EB:洗脱液，提供低盐高Ph环境实验六质粒的酶切1原理利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。2结果质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。实验七CTAB法提取植物基因组DNA。。1利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞。2EDTA抑制DNA酶活性。3再用氯仿抽提去除蛋白，得到的DNA用乙醇沉淀4CTAB的作用：除去多糖，沉淀DNA5Na