ELISPOT技术原理及其应用

DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.酶联免疫斑点EnzymeLinkedImmunoSPOT达科为生物技术有限公司朱义鑫2005.11.30Elispot实验结果（透明板）U-Cytech公司Elispot实验结果（PVDF板）U-Cytech公司达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.1.ELISPOT技术起源与发展2.细胞与细胞因子3.ELISPOT技术原理4.ELISPOT和ELISA的区别5.ELISPOT的优点第一部分：前言达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.1983年,Czerkinsky&Sedgwick：计数分泌抗体的B细胞；1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶;1988年，Czerkinskyet.al.:首次将应用扩展到细胞因子检测领域，TcellIFN-γ;同年业发展出双色标记技术；1995年，Schielenet.al.:首次将PVDF膜板引入ELISPOT1997年，Guiet.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。1.ELISPOT技术起源与发展达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫(Th1)和体液免疫(Th2)抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子Th1cellsIFN-γ,IL-2Th2cellsIL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-13TccellsIFN-γ,TNF-β,颗粒酶B，穿孔素单核/巨噬细胞TNF-a,IL-1b,IL-6,IL-10,IL-12细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。2.细胞与细胞因子达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。3.ELISPOT技术原理达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.4.ELISPOT和ELISA的区别ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同:ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是细胞频率；（整体水平与单细胞水平）ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测）ELISA检测的特异性表现在抗体上，ELISPOT检测的特异性及表现在双重的刺激源和抗体上。达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.5.ELISPOT的优点目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：ELISA、ELISPOT、FACS、Tetramer、3H胸苷参入法、51Cr释放法。高灵敏：度少至100－1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACS灵敏。高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。HighThroughputScreening达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.在106抗原呈递细胞（APC）中混入已知数量的IFN-γ阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。X坐标：各检测方法的检测结果Y坐标：每百万APC中实际IFN-γ+T细胞数量ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较ELISPOT流式荧光染色ELISA达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.第二部分：技术特点1.技术操作流程2.ELISPOT技术要点3.塑料板与膜板4.膜结构与抗体包被5.细胞处理6.有血清与无血清7.刺激物选择8.建立阳性对照9.调整适当的细胞浓度10.预培养法与直接法11.各种染色系统达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.1.包被抗体4℃过夜，洗涤；2.封闭37℃1h；3.加入淋巴细胞和刺激原37℃孵育8-40h；4.冰水裂解并移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的检测抗体37℃1h，洗涤；6.加入酶联亲和素37℃1h，洗涤；7.加入显色底物，显色10~40min；8.获得斑点，计数。1，23456781.ELISPOT一般操作流程达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.2.ELISPOT技术要点细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.塑料板：U-cytech公司特有的透明版操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初学者以及临床诊断。膜板：PVDF膜板、NC膜板操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。3.塑料板与膜板达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.塑料板：U-cytech公司特有的透明版优点：透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；可以快速包被，节省实验时间；可回收细胞和上清；价格只有PVDF膜板的一半。缺点：吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；只有一种染色系统，不能用于多色分析。修饰的HRP/银染系统达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.膜板：PVDF膜，NC膜优点：PVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；斑点颜色鲜艳，易于判读；能用于多色ELISPOT实验。缺点：需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；几乎不可能回收细胞和上清；膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。HRP/DABAP/BCIP&NBTHRP/AEC达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.IFN-IL-5IL-10IFN-PMA/ionomycin2.5x104hu-PBMCindirecttetanus105hu-PBMCindirectConA2.5x104hu-PBMCindirectICEPeptidePool2x105hu-PBMCindirectIL-5IL-12p70IFN-PMA/ionomycin2x105hu-PBMCindirectLPS/IFN-2.5x104hu-PBMCdirectICEPeptidePool2x105hu-PBMCindirectPVDF板、透明板的典型斑点图像达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.4.膜结构和抗体包被通常的包被条件是4℃过夜，也可以室温2小时37℃包被不能超过1小时，否则包被效率急剧降低膜吸附能力远远超过包被抗体的量，所以需要封闭包被后必须接着封闭，否则包被抗体会逐渐失活封闭之后用纯水或PBS洗涤，可以在4℃长期存储关于膜的一些参数（单孔面积）厚度：120-150um最大蛋白吸附量：80-100ugELISPOT所需量：1ug包被抗体集中于膜表面1um(透明板容纳量为：30-40ug)达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.从外周血提取淋巴细胞时,应避免凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6小时。只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液预培养的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成预培养后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养5.细胞处理达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.6.有血清与无血清血清是细胞培养所必需的添加品，ELISPOT有细胞培养的过程，所以需要血清但是血清批次间差异大、成分未可知，为ELISPOT增加了严重的不确定性因素。有些批次的血清严重干扰试验结果。无血清培养法已经成熟，其优点：成分固定，彻底消除了批次间的差异，结果可以在全世界的试验室之间比较。不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。目前只能用于直接法，间接法孵育时间过长，细胞生长受影响，结果不理想。119SFC267SFC我们自己的试验结果：PHA/10,000Hu-PBMC上：5%小牛血清（杭州）下：无血清培养基U-cytech)达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.非特异性刺激物有丝分裂原ConA，PMA，PHA，Ionomycin特异性刺激物重组蛋白病毒载体或者病毒颗粒重叠肽段表位肽注意：直接在ELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用预培养法。部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等。7.刺激物选择达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.8.建立阳性对照非特异性刺激阳性对照：ConA伴刀豆蛋白A0.4-1.0ug/wellPHA植物血球凝集素0.3-1.0ug/wellIonomycin伊诺霉素50-100ng/wellPMA14烷酰佛波乙酯5.0-10ng/well特异性阳性刺激原：国际标准多肽池CEFCMV，EBV，influenzavirus在PBMC的IFN-γELISPOT分析中：•自发斑点频率：10～50/百万PBMC细胞；(十万分之一）•PHA刺激频率：104～105/百万PBMC细胞；（百分之一）•CEF刺激频率：500～5000/百万PBMC细胞（千分之一）达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.阳性对照实例未刺激40SFC/百万PBMCCEF刺激3，400SFC/百万PBMCPHA刺激26，000SFC/百万PBMC人PBMC40万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC1万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC5万/孔U-cytech无血清培养基4265177达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.9.调整适当的细胞浓度84449235519240万20万10万5万20-40万/孔形成最大密度的单层细胞根据所使用刺激原作初步调整ConAPHAPMA：0.5-5万/孔特异性刺激物：5-40万/孔根据预实验的斑点数目作精细调整人PBMC/CEF刺激U-cytech无血清培养基达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.10.预培养法与直接法预培养法即：预先将细胞和刺激物加入24孔板中作预孵育和刺激，然后再加入ELISPOT板进行实验。大多数ELISPOT实验都可以用直接ELISPOT法得到可接受的结果。预孵育的优点：经过预孵育，斑点更分散，清晰可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒酶、IL-10预孵育的缺点：需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境需耗费额外的物资和时间达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.直接法PVDF刺激物：ICEPeptidePool40Hours,2X105Cell/Well预孵育法PVDF刺激物：ICEPeptidePool24+16Hours,2X105Cell/WellIFN-γ直接法与预培养法比较达科为生物DAKEWEBIOTECHCOMPANYLtd.直接法PVDF刺激物：破伤风杆菌40Hours,2X105Cell/Well预孵育法PVDF刺激物：破伤风杆菌24+16Hours,2