基因沉默原理

‐ 1 ‐  目录RNAi及基因沉默原理百奥迈科（Biomics）RNAi产品与服务一览1.siRNA生物合成1.1全位点siRNA表达文库构建服务1.2RNAi载体构建技术服务1.3GeneTargetTMsiRNASet2.siRNA化学合成2.1化学合成siRNA简介2.2siRNA设计2.3百奥迈科(Biomics)siRNA产品简介2.4普通siRNAoligo2.5荧光标记siRNAoligo2.6化学修饰siRNAoligo2.7miRNA的化学合成2.8RNAi系列优惠套餐2.9siRNA对照3.RNAi病毒包装3.1腺病毒载体包装3.2慢病毒载体包装3.3其他类型病毒载体包装4.哺乳动物细胞siRNA转染4.1转染方法4.2转染步骤4.3转染优化及注意事项5.mRNA水平检测基因沉默5.1mRNA的提取/制备5.2.实时定量荧光PCR6蛋白质水平检测基因沉默6.1Westernblot6.2ELISA6.3免疫荧光7.其他相关服务7.1稳定细胞筛选服务7.2细胞增殖毒性检测服务7.3细胞凋亡检测服务7.4DNA测序8.RNAi相关产品8.1RISOTMRNA抽提试剂8.2其他‐ 2 ‐  RNAi及基因沉默原理RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21-25nt及3'端突出的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。‐ 3 ‐  百奥迈科（Biomics）RNAi产品与服务一览‐ 4 ‐  1.siRNA生物合成1.1全位点siRNA表达文库构建服务本公司拥有自主知识产权的全位点siRNA文库构建技术，能够从全长cDNA构建包含所有有效结合位点，长度分布于19-23bp的靶基因的siRNA分子库，亦可以模仿体内Dicer酶切割长度为21-23bp的分子库，适用于高通量功能基因及相关药物靶点筛选。1.1.1构建流程：1）客户可选：z提供靶基因的cDNA克隆。z提供靶基因的相关信息(基因的mRNA序列或GenbankAccessionNumber)。z也可在本公司的cDNA产品目录中，挑选靶基因cDNA克隆。2）进行siRNA文库构建，抽样测序验证。3）根据客户要求提供相应的文库产品。4）将其连同抽样报告、产品说明书一起寄送到客户手中。A.HBVPolymeraseDomainsiRNA表达文库位点分布（随机抽样测序）PolymeraseDomain(984bp):B.构建的Survivin基因全位点siRNA表达文库，文库抽样基因沉默(qPCR)筛选结果：该数据显示，本公司siRNA文库位点分布的随机性，可以更好地找到昀优的靶点。s1-s8:RandomlyselectedsiRNAsequencesfromBiomicslibrarys9/s10/s11:ThepublishedsiRNAsequencestarget-off:Negativecontrolun-transfect:Untreatednormalcontrol‐ 5 ‐  1.2RNAi载体构建技术服务1.2.1技术特点：1）多种siRNA表达载体，可以在细胞内直接转录出siRNA，行使其RNAi功能，包括：zU6启动子表达载体；zH1启动子表达载体；zU6、H1双启动子表达载体；zCMV启动子表达载体；2）载体带有GFP标签可以监测转染效率。构建好的siRNA表达载体可直接用于转染细胞进行RNAi实验;3）本公司还可根据客户需要提供各种商业化表达载体;4）本公司可以为客户构建线性siRNA表达载体，shRNA表达载体，miRNA表达载体以及病毒型RNAi载体。1.2.2构建流程：1）siRNA靶点设计；z客户提供靶基因的siRNA序列，由本公司将其克隆到siRNA表达载体上。z客户提供靶基因的相关信息（基因的mRNA序列或GenbankAccessionNo.），根据客户要求，本公司设计高效特异性的3-4条针对靶基因的siRNA。2）合成设计好的DNA并退火形成双链DNA，克隆到客户要求的载体上。3）通过测序进行验证。4）构建成功的siRNA质粒连同测序报告、产品说明书一起寄送到客户手中。注：可根据客户要求提供siRNA的阳性及阴性对照质粒。1.2.3质量保证：符合设计要求的siRNA序列测序结果。基于载体的RNAi实验示意图‐ 6 ‐  1.2.4各种商业化表达载体:产品编号载体启动子筛选基因标记基因BV0011pRNAi-U6H1/NeoU6和H1NeomycinGFPBV0012pRNAi-H1.1/NeoH1NeomycinGFPBV0013pRNAi-U6.1/NeoU6NeomycinGFPBV0014pRNAi-CMV3.1/NeoCMVNeomycinGFPBV0015pRNAi-CMV3.2/NeoCMVNeomycinGFPBV0016pRNAi-CMV4.1/NeoCMVNeomycin-BV0107pRNAi-U6.1/LentiU6NeomycinGFPBV0108pRNAi-H1.1/RetroH1NeomycinGFP‐ 7 ‐  1.3.GeneTargetTMsiRNASetGeneTarget™siRNASet是本公司的专利技术开发的基因沉默系列产品之一。产品由4个不同位点的siRNA克隆组成，可以降低在基因沉默中产生的脱靶现象，提高沉默效率。四个克隆可以混合使用，也可以单独使用。产品均经基因测序证实，保证其100%的同源性。本产品有如下特点：z在U6和H1启动子的起始序列AAAAA和终止序列TTTTT之间的siRNA片段没有多余的多克隆位点序列，提高沉默的特异性。zsiRNA表达框（U6－siRNA－H1）可以整体亚克隆到逆转录病毒载体(Retrovirus)、腺病毒载体（Adenovirus）、慢病毒载体（Lentivirus），具有较好的适用性。zsiRNA没有二级结构(如发夹型结构)，在上述病毒载体中较稳定。z构建的质粒载体转染到细胞内，在细胞内转录出双链RNA，在细胞内具有中长期表达的特性，能够较长期的发挥基因沉默的作用。z由于质粒可以复制扩增，较化学合成方法显著降低制备siRNA的成本。z载体法的siRNA可测序保证100%序列同源性，而化学合成的siRNA分子的序列鉴定较困难。表达载体pU6H1-GFP图谱产品性状形态：本产品具有可靠的稳定性，以质粒DNA与滤纸小圆片共干燥封装，可在常温下运输和储存。GeneTargetTMsiRNASet产品包含：1.特定基因4个位点的GeneTargetTMsiRNAClone。2.阳性对照1管（用于平行跟踪转染、RNA提取等实验过程，排除假阴性结果。）3.阴性对照1管（阴性对照的siRNA与目的基因以及靶细胞中其它基因mRNA没有同源性，排除假阳性结果。）‐ 8 ‐  GeneTargetTMsiRNASet产品目录 Cat.No.ACCNNo.DescriptionKinaseK07002NM_145262Homosapiensglyceratekinase(GLYCTK)K07003NM_145259HomosapiensactivinAreceptor,typeIC(ACVR1C)K07004NM_153361HomosapienshypotheticalproteinMGC42105(MGC42105)K07005NM_153273Homosapiensinositolhexaphosphatekinase1(IHPK1),transcriptvariant1K07007NM_152720HomosapiensNIMA(neverinmitosisgenea)-relatedkinase3(NEK3)K07008NM_030906Homosapiensserine/threoninekinase33(STK33)K07009NM_020804HomosapiensproteinkinaseCandcaseinkinasesubstrateinneurons1(PACSIN1)K07012NM_172170Homosapienscalcium/calmodulin-dependentproteinkinase(CaMkinase)IIgamma(CAMK2G),transcriptvariant3K07016NM_152835HomosapiensPDLIM1interactingkinase1like(PDIK1L)K07021NM_015000Homosapiensserine/threoninekinase38like(STK38L)K07026NM_174858Homosapiensadenylatekinase5(AK5),transcriptvariant1K07027NM_173354HomosapiensSNF1-likekinase(SNF1LK)K07029NM_033015HomosapiensFas-activatedserine/threoninekinase(FASTK),transcriptvariant4K07030NM_032844Homosapiensmicrotubuleassociatedserine/threoninekinase-like(MASTL)K07033BC032542Homosapiens,L-fucosekinase,cloneMGC:45494IMAGE:5534376,completecdsK07035NM_032028Homosapienstestis-specificserinekinase1(TSSK1)K07041NM_031414Homosapiensserine/threoninekinase31(STK31),transcriptvariant1K07046NM_182691HomosapiensSFRSproteinkinase2(SRPK2),transcriptvariant2K07054NM_032409HomosapiensPTENinducedputativekinase1(PINK1),nucleargeneencodingmitochondrialproteinK07055NM_023018HomosapiensNADkinase(NADK)K07056NM_024876HomosapiensaarFdomaincontainingkinase4(ADCK4)K07057NM_006153HomosapiensNCKadaptorprotein1(NCK1)K07059NM_006293HomosapiensTYRO3proteintyrosinekinase(TYRO3)‐ 9 ‐  K07060NM_024761HomosapiensMOB1,MpsOneBinderkinaseactivator-like2B(yeast)(MOBKL2B)K07061NM_173515HomosapiensCNKSRfamilymember3(CNKSR3)K07066NM_002497HomosapiensNIMA(neverinmitosisgenea)-relatedkinase2(NEK2)GeneTargetTMsiRNASet产品目录 Cat.No.ACCNNo.DescriptionK07067NM_002350Homosapiensv-yes-1Yamag