细胞增殖及细胞活力检测方法1

细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cellviability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。MolecularProbes公司的Click-iTEdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书）在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，AlamarBlue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一种四唑盐试剂WST-1来对细胞活力进行快速的检测。线粒体剪切WST－1试剂，产生一种水溶性的formazan盐，所以这是一种相对可靠的测定健康细胞活力的方法。一种类似的但更为灵敏的方法是Calbiochem公司的超敏细胞增殖试剂盒，采用calcein-AM（一种荧光探针）来标记细胞。这种增加的灵敏度来自于额外的检测步骤，即采用PBS替代培养基或血清来减小背景。Invitrogen公司还提供了一种采用荧光素酶检测细胞内ATP水平的方法。健康细胞中荧光素激发出的光可以很容易读出，并且具有非常小的背景。无荧光信号表明细胞线粒体不在产生ATP。因此，这些方法当然也可用于细胞毒性检测实验。自由基（FreeRadical,FR）是含有孤电子的原子或原子团，活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢（H2O2）、单线态氧、羟自由基（HO·）、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。FR和ROS在细胞内可通过酶反应和非酶反应产生。其中线粒体是细胞内FR和ROS产生的主要来源，约占细胞内FR和ROS总量的98%左右[1]，由于线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)浓度较高，大部分O2·-歧化为H2O2，后者可穿过线粒体膜进入胞浆。细胞内膜系统如滑面内质网及过氧化物酶体里含有一些酶,如细胞色素p-450和b3家族、乙醇酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、尿酸氧化酶等，这些酶对脂溶性药物、不饱和脂肪酸、抗生素及其它代谢产物的氧化，亦可产生H2O2和O2·-等[2，3]。除此以外，一些可溶性氧化酶、吞噬细胞NADP氧化酶、磷脂酶A2(PLA2)等催化的反应，以及某些小分子的自氧化均是内源性ROS产生的重要来源[1]，配体反应也可介导产生FR和ROS[4]。衰老的自由基学说认为，随着细胞复制衰老或生物整体衰老，FR和ROS在衰老的细胞和组织内累积，损伤生物大分子如蛋白质、脂类、核酸等，造成其结构改变和功能丧失，甚至引起基因突变、DNA复制停止等，最终引起复制衰老和整体衰老，FR和ROS经由哪些途径引起衰老的呢？1．FR和ROS可改变细胞的氧化还原状态。细胞内的氧化还原状态主要由谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(TRX)两对缓冲对进行调节，FR和ROS可氧化GSH和TRX，改变细胞内相对稳定的氧化还原状态，进而影响信号传导[5]。2．FR和ROS通过氧化蛋白质侧链上关键的氨基酸残基，如丝氨酸的羟基和半胱氨酸巯基，进而改变蛋白质的结构、影响蛋白质多聚化、蛋白质与Fe-S或其它金属离子的结合等。如被氧化修饰的-OH或-SH位于酶的催化中心，则酶的催化活性丧失；如被氧化修饰的氨基酸残基位于DNA结合域，则转录因子失去了与DNA结合及调控转录的能力；而蛋白质若不能与Fe-S结合，则呼吸链电子传递及氧化磷酸化受阻。另外，损伤的蛋白质半寿期延长，而衰老的细胞中蛋白质合成速率下降，导致受损伤的蛋白质更新率下降[6]。3．FR和ROS可氧化DNA，使其断裂或突变，DNA复制和转录受阻[7，8]。如果FR和ROS导致的DNA单链断裂发生于染色体端区末端，则端区缩短加快。在正常培养条件下，人二倍体成纤维细胞的端区缩短速率主要取决于细胞内的氧化压力[9]。4．FR和ROS加速了细胞内非酶糖基化反应，以及大分子如蛋白质之间的交联[10]。5．FR和ROS损伤端区，可能引发了衰老相关基因如p16和p21的过表达。MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1.MTT法MTT：化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。2.XTT法XTT：化学名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。3.CCK-8法或称WST-8法CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲产物（Formazan）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。缺点:1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。三种方法的比较MTT法XTT法CCK-8法（WST-8法）甲物水溶性难溶性水溶性水溶性检测波长490nm450nm450nm性状粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用毋需预制使用有机溶剂DMSO或其它溶剂——方便性++++++检测速度++++++重复性+++++稳定性+++++工作量------对细胞毒性------对人体毒性-----一、简介流式细胞仪（一）流式细胞仪概念流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。（二）原理待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。（三）流式细胞仪检测的细胞特性细胞结构组成细胞功能大小细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度细胞活性DNA、RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子、pH值、膜电位酶活性人体抑癌基因。