从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)

从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序一、目的本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。二、适用范围：本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。三、生物安全要求标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。四、试剂及仪器设备4.1试剂采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管4.2仪器设备恒温培养箱、微生物鉴定仪五、采样方法5.1标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。5.2粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。5.3肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。5.4标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。六、检验程序七、操作步骤粪便标本或肛子XLD或麦康凯SBG增菌XLD或显色平板可疑菌落接种TSI和MIU生化符合者做血清凝集和系统生化反应菌株保存管保存菌株上送可疑菌落接种TSI和MIU生化符合者做血清凝集和系统生化反应7.1分别标记一个XLD平板（或YS平板、麦康凯平板）和1管9ml改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）（或SF增菌液或沙门志贺培养液）。7.2用1个无菌拭子取少量标本（不要使拭子粘得太多，尽量从可见血或黏液的部位收集）接种在XLD平板的第一区，接着把拭子放入SBG增菌液。再灭菌接种环在XLD平板的其余区进行划线接种。如果是Cary-Blair运送培养基的粪便拭子，则轻搅混合标本后接种增菌液与平板。7.3所有培养基均放入36℃±1℃培养，SBG的最佳增菌时间是16～18h（建议每天下午4~5时接种标本，第二天早上8~10时用增菌液划平板）。7.4观察平板：取培养后的平板，观察有无可疑菌落。7.4.1XLD平板可疑菌落观察：志贺菌在XLD平板上为粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形菌落，直径1-2mm，而大部分的大肠杆菌类的菌落为黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则，直径2-3mm。大多数沙门菌在XLD平板上中心黑色的透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形的菌落。（图2）7.4.２YS平板可疑菌落观察：7.4.３麦康凯平板可疑菌落观察：志贺菌在麦康凯平板上为无色至浅粉色、半透明、光滑、湿润、边缘整齐或不规则、圆形菌落，直径2-3mm；大多数沙门菌为无色菌落，粉红色，带或不带黑心，伤寒沙门菌为无色菌落；而大部分的大肠杆菌类的菌落为粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则，直径3-4mm。7.4.４SBG肉汤增菌：SBG增菌16~18小时后，划线接种XLE平板或沙门显色平板，放入36℃±1℃培养18～24h。沙门显色平板可疑菌落观察：典型的沙门菌在沙门显色平板上为紫色的菌落，直径2-3mm。7.4.4建议的初步筛查方案（初步生化特征见表1）：表１沙门菌、伤寒沙门菌、志贺菌及常见肠道菌的初步生化特征大部分沙门菌伤寒沙门菌志贺氏菌大肠杆菌枸橼酸杆菌变形杆菌TSI（斜面）K（红色）K（红色）K（红色）A（黄色）A（黄色）K（红色）TSI（底面）A（黄色）A（黄色）A（黄色）A（黄色）A（黄色）A（黄色）TSI（H2S）+（黑色）小部分--+（黑色）+（黑色）TSI（产气）+（气泡）--+（气泡）+（气泡）+（气泡）MIU（动力）+（弥漫生长）+（弥漫生长）-（沿接种线生长）+（弥漫生长）+（弥漫生长）+（弥漫生长）MIU（吲哚）-（黄色圆环）-（黄色圆环）-（黄色圆环）+（加试剂变红色）+（加试剂变红色）-（黄色圆环）MIU（尿素）-（黄色）-（黄色）-（黄色）-（黄色）-（黄色）+（红色）A：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌XLD分离接种TSI和MIUB：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌YS分离接种TSI和MIUC：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌XLD和麦康凯分离接种TSI和MIUD：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌YS和沙门显色分离接种TSI和MIUE：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌XLD和沙门显色分离接种TSI和MIU7.5生化初步鉴定每个平板挑取3~5个分离较好的单个可疑菌落，分别接种到三糖铁（TSI）和动力-吲哚-尿素培养基（MIU），36℃±1℃培养18～24h。沙门菌和志贺菌的生化特征见表2。7.6系统生化试验沙门菌和志贺菌初步鉴定阳性菌经转种营养琼脂单，取单个菌落进行系统生化鉴定（可以使用APE20E或全自动生化鉴定系统进行）。7.7血清学试验7.7.1志贺菌血清学试验7.7.1.1挑取生化反应实筛符合志贺菌的营养琼脂斜面，首先用四种多价血清做玻片凝集反应(4种多价包括：A群1、2型；B群和D群)。凝集者则用B群多价、D群和A1、A2、血清分别凝集。7.7.1.2若多价血清不凝集，可能为C群或A群的3～12型，应进行C群的四种多价和A群另三种多价血清做玻片凝集。7.7.2沙门菌血清学试验7.7.2.1挑取生化反应实筛符合沙门菌的营养琼脂斜面，首先用A-F群O多价血清做玻片凝集反应。7.7.2.2若凝集可按常见O因子检出频率，按照O4→O10→O9→O7→O8→O19→O2→O11顺序凝集。7.7.2.3H抗原凝集7.7.3所有凝集阳性的菌落，都要同时用生理盐水做凝集试验，只有不出现自凝时，才可以报告阳性结果。8结果报告8.1在初步生化鉴定符合后，可以先将可疑菌落进行革兰氏染色，最后综合生化及血清学结果，可以报告检出（或未检出）沙门菌（或志贺菌）。8.2对于从业人员体检结果已经纳入检验软件管理的单位，可以直接在检验软件中录入相应结果。8.3其他单位可以设计专门的报告格式反馈给送检单位或送检科室，检验报告中应至少包括姓名，性别，年龄，体检编号，检测结果。8.4检测结果为阴性，可以报告为未检出肠道沙门菌和志贺菌；检测结果为阳性，根据检测情况报告具体的型别。8.5检验部门应该保留所有受检样品的基本信息，检测到阳性标本，应该保存详细的检测记录，根据需要提供给送检单位或科室，以及上级业务单位。9菌株的保存对于生化及血清学结果符合沙门菌或志贺菌的菌株用磁珠保存管保存菌种，放入-２０℃或-７０℃保存，按照相关要求上送菌株。