植物组织培养无病毒苗培养

第六章无病毒植物的培养教学目的和要求(1）了解植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义。（2）理解和掌握脱除植物病毒的原理及方法。（3）分离茎尖及培养方法。（4）掌握无毒苗木的鉴定方法。（5）掌握脱毒苗木的保存和利用方法。第一节植物病毒的危害和培养无病毒植物的意义病毒之所以致病不是由于消耗细胞养分、通过毒素杀死细胞，而是利用细胞内物质繁殖，干扰细胞的代谢过程，在寄主细胞内产生一些对细胞正常功能有害的异常物质和条件，这使得植物病毒病的防治较其他植物病害防治更为困难，常给生产带来灾难的损失，被称为“植物的癌症”。一、植物病毒的危害植物病毒已超过600种，严重危害着农业生产。在果树、蔬菜、花卉、林木以及农作物上皆有发现。随着生产栽培时间的推移，危害越来越严重，发现的病毒种类也越来越多。病毒症状危害园艺植物的病毒数目如侵染菊花的病毒和类病毒有19种之多如无子病毒(CAV)潜隐病毒(CLV)B病毒(CVB)轻斑驳病毒(CMMV)矮化病毒(CSV)脉斑驳病毒(CVMV)退绿斑驳类病毒(CCMV)等•4种病毒对草莓生产造成重大影响:斑驳病毒（SMoV）草莓黄边病毒（SMYEV）草莓镶脉病毒（SVBV）草莓皱缩病毒（SCrV）、甘薯根腐病.甘薯叶点病甘薯枯萎病甘薯黑痣病2.病毒的特性及其侵染多数植物病毒不经种子传播，多数以种子繁殖后代的植物，可以从轻度染病植株上采集种子，播种繁殖，不会将病毒传至下一代。（专化性强的病毒除外，如豆类病毒——由一种专化性强的蚜虫传播)可随着种子传播。）对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖的植物，一旦染病则毫无办法。母株一旦染病，病毒在其细胞内增殖，并通过插条、接穗、种薯、球根、鳞片传至下一代。通过昆虫作为媒介加速传播。３.植株脱病毒的意义•植物组织培养脱病毒技术是植物细胞工程的重要组成部分，脱毒种苗的生产在提高作物质量和产量方面已显示出极大潜力，良种、新品种的脱毒组培苗的大面积推广和应用，有效地解决了因病毒引起的品种退化问题。因此，植物组培脱毒技术在农业生产的科学化、现代化中具有巨大的应用价值和经济效益，还可减少农药的施用，改善生态环境条件，防止病害的蔓延与扩散，该方法已成为农业中应用最广泛的生物技术。脱毒苗病毒活力与温度的关系第二节脱除植物病毒的原理及方法一、物理学方法：X射线紫外线超短波高温都能使病素钝化，其中以热处理最常用。1.热处理脱除植物病毒的原理①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后；随植物细胞的DNA一起复制。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。②热处理是一种物理效应，与冷处理一样，它可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。（1）温汤浸渍处理法：将剪下的接穗或种植材料，在50℃左右的温水中，浸渍3-15分钟至数小时。（2）热风处理法：让盆载植物在35-40℃高温下生长发育，热处理空气温度应逐渐升高，然后达到所需温度，同时必须保持一定的湿度和光照，以后可切取处理后新长出的枝条作接穗和砧木，或将热处理与组织培养结合效果更好。热处理脱毒2、愈伤组织热处理脱毒法方法：从患病植株上取叶片(茎片、鳞片、花器亦可)进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。常用处理温度及处理时间：温度：37-38℃时间：处理2周、4周或8周温度：50℃时间：3-15min。反复继代兼热处理，经历一定的时间(继代次数需试验)后，将热处理过的愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化。果树作物：桃(无黄萎病)、苹果(花叶病)、葡萄(扇叶病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、树莓、红莓苔子、草莓等。蔬菜作物：马铃薯、番茄、菠菜。花卉植物：蔓生长春花、康乃馨、菊花等。其他植物：曼陀罗等。例：烟草愈伤组织兼热处理钝化烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)获得无病毒株效果做法：A：从患病烟草植株上取5mm叶片培养，在MS附加IAA2mg/L+KT0.2mg/L的培养基上诱导愈伤组织。B：将其中一部分愈伤组织反复继代培养，继代培养中分别兼用25℃、30℃和37℃温度热处理8周。C：将热处理后的愈伤组织，转到MS附加IAA2mg/L+KT2mg/L的分化培养基中诱导芽分化。D：将1cm长的芽转移到MS附加IAA2mg/L+KT0.02mg/L生根培养基，诱导根分化。E：完整植株获得后，移植到无毒土壤栽培并进行鉴定。结果表明：反复继代培养可获得无病毒株。3.低温处理脱除病毒•菊花植株----5℃,4-7.5个月处理后进行茎尖培养,可以除去矮化病毒(CSV)和褪绿班驳病毒(CCMV),而单独的茎尖培养无此效果。二、化学方法使用农药是防治植物真细菌病害的主要方法，理论上讲，也应该是防治病毒的有效途径。有不少化学物质能抑制病毒复制，例如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、以及某些病毒抑制剂。如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白质、核酸合成抑制剂等。由于病毒的复制和寄主的代谢过程关系非常密切，因此，要找出既干扰病毒复制，又不影响寄主细胞正常代谢的药剂十分困难。利用这些化合物处理整株植物去病毒的效果虽不理想，但培养离体的组织、细胞和原生质体等却可能有良好效果。如在培养基中加入2—硫尿嘧啶可以除去烟草愈伤组织中的PVY病毒，加入放线菌素D可以抑制原生质体中的病毒复制等。钝化、抑制和清除植物病毒的一些化合物三、生物学方法1.茎尖培养脱毒（1）茎尖培养脱毒的理论基础a、病毒在植物体内的转移是通过维营束系统完成的，在分生组织区域内没有维管束组织，病毒只能通过胞间连丝传递赶不上细胞的不断分裂和活跃的生长速度；b、在分裂旺盛的分生组织内，病毒的复制受到旺盛代谢活动的限制；c、在植物分生区域内，“病毒钝化体系”的活性较其他部位的活性高；d、茎尖分生组织内高浓度的植物内源激素可能会抑制病毒的增殖。（2）茎尖培养脱毒苗的方法在解剖镜下剥取茎尖。考虑到脱毒效果及提高成活率，一般切取0.2—0.5mm的茎尖为组织材料进行培养，不同的植物茎尖对外源激素的反应不同。茎尖大小:过大时接种易成活，但脱毒效果差，过小时难成活，但脱毒效果好。一般以带有1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3mm为宜，超过0.5mm时，脱毒效果差。培养基:只要能使茎尖快速生长，分化快的培养基均适于脱毒。一般以MS较好，添加一定比例的细胞分裂素就行。马铃薯的芽茎尖的结构Viruselimination•whydoesthemeristemhavelow/novirustitre?–virusspreadsprimarilythroughvascularsystem-thisisnotdevelopedinthemeristem–mitosisandchromosomereplicationcompetewithvirusreplication–highauxininmeristeminhibitsvirusreplication–avirus“inactivating”systemhasgreatestactivityinmeristemTobaccomeristemvirus-freetissuevirusparticlesfoundhere微茎尖普通茎尖马铃薯脱毒苗康乃馨不同茎尖培养与康乃馨斑驳病毒的脱除情况(3)茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键①同一种病毒在不同植物体内分布部位不同。例：烟草花叶病毒(TMV)在如下植物中的荧光反应。烟草：l-4片叶原基中未见TMY特异荧光撞羽矮牵牛：一两片叶原基未见TMV特异荧光，而在三四片叶原茎中可见TMV荧光。番茄：1片叶原茎中未见TMV特异荧光。所以在用茎尖培养脱毒时，必须认真确定病毒在植物茎尖中的分布部位，然后确定培养茎尖的大小.番茄：只能取生长锥或仅带一片叶原基的茎尖进行培养；撞羽矮牵牛：可取生长锥或带一两片叶原基的茎尖进行培养；烟草：可取带4片叶原基的茎尖进行培养。利用茎尖培养法脱除植物病毒时，最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点(茎尖)大小的相关性，这样在取材时就方便多了。•茎原基0.05~0.08mm茎原基带2片叶原基0.1~0.2mm茎原基带4片叶原基0.3~0.4mm茎原基带6片叶原基0.6~0.8mm②不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同。甘薯斑纹花叶病毒、缩叶花叶病毒：分布于1.0-2.0mm以内的茎尖中羽毛状花叶病毒：分布于0.3-1.0mm以内茎尖中马铃薯马铃薯卷叶病毒、Y病毒：分布于1.0-3.0mm以内的茎尖中；X病毒：分布于0.2-0.5mm以内的茎尖G病毒：分布于0.2-0.3mm以内的茎尖S病毒：0.2mm以下2.愈伤组织培养脱毒植物各部位器官和组织培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。说明病毒颗粒会在愈伤组织的培养过程中逐渐消失。愈伤组织脱病毒的机理•可能的原因有：①病毒在植物体内不同器官或同一器官的不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞增殖产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。②有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒的复制能力衰退或丢失。③继代培养的愈伤组织容易产生抗性变异细胞，因而可能出现不带病毒的愈伤组织。但经愈伤组织产生无病毒苗的脱毒途径容易产生变异，可能导致植株丧失其原有的优良性状，当然也有可能产生有益的变异，但频率极低。3.茎尖微体嫁接脱毒先将砧木种子进行表面消毒，以后再接到1%琼脂以MS无机盐培养基培养发芽，用苗龄约2周的幼嫩实生苗作砧木。把实生苗从试管中取出，在无菌条件下切去顶部，留下1-1.5cm的上胚轴部分，将子叶和腋芽除去，把根切短至4—6cm长。从田间或温室旺盛生长的成年树剪取一小段新梢，经消毒后在超净台上用显微操作法取出仅带1-3个叶原基的茎尖约1mm大小作穗用。采用倒T字形的水平切口。嫁接苗用液体滤纸桥培养基培养。成活率30%—50%，嫁接成功的植株移植到土壤之前至少要有两片展开的真叶。苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率苹果不同取材时期对微体嫁接成功率的影响试管微体嫁接在果树方面发展最快(1)嫁接植物不受与珠心及有性实生苗相关的幼年阶段的影响。(2)许多栽培品种通过嫁接繁殖了许多世代，因此果树研究者和种植者关于这些品种的自根苗的根冠大小、病虫害情况以及耐寒性等了解得很少。(3)茎尖组织培养繁殖结合热处理可产生无病毒植物，因此，许多研究者认为对通常采用嫁接繁殖的果树进行试管嫁接是很适宜的。(4)试管微体嫁接除了可培育无病毒植株外，还可解决难以生根的园艺植物的生根问题和进行嫁接亲和力的研究。4.珠心胚培养脱毒柑桔类80%以上的种类具有多胚性,而单胚占的比例很小。•柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成的无性胚，称做珠心胚。因为病毒通常是经维管束的韧皮组织传播的，而珠心与维管束系统无直接联系。由珠心组织诱导产生的植株就可免除病毒的危害。①它与合子胚不同，不是受精的产物，而是由体细胞产生的，因此具有和母体相同的遗传组成；②与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组织连系，因此即使母体植株感染了病毒，珠心胚也是无毒的；③在自然条件下，珠心胚一般都不能发育成熟，只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应当是不带病毒的母体无性系。珠心胚具有3个特征5.花药培养脱毒花药培养的最初目的，是培育起源于花药内部花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。但经大量实验表明花药培养所得的植株有95%以上是能开花结果的多倍体，而且生长发育都优于母株。已证明，经愈伤组织培养出来的花药植株是不带病毒的，借此方法，不仅可快速培育出大量的无毒植株，并可省去病毒鉴定工作，对基层生产应用实为一举两得的事情。三、分离茎尖的培养情况第一种：是生长停止，接种的组织扩大，颜色逐渐变褐而枯死，这种情况大多是生长点在分离接种过程中受伤而造成的；第二种：是生长太慢，茎尖接种后颜色逐渐变绿，但不见增大，最后成绿色小点。这是由于生长素浓度偏低，或培养温度过低所造成