乳清成分测定方法

干酪副产物乳清特性的影响一、乳清主要成分的测定1、乳清中蛋白质的测定（分光光度法）原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。仪器：（1）分光光度计（2）电热恒温水浴锅：100℃±0.5℃（3）10mL具塞玻璃比色管。（4）天平：感量为1mg试剂:（1）硫酸铜（CuSO4·5H2O）。（2）硫酸钾（K2SO4）。(3)硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）：优级纯。(4)氢氧化钠。(5)对硝基苯酚（C6H5NO3）。(6)乙酸钠（CH3COONa·3H2O）。(7)无水乙酸钠（CH3COONa）。(8)乙酸（CH3COOH）：优级纯。(9)37%甲醛（HCHO）。(10)乙酰丙酮（C5H8O2）。(11)氢氧化钠溶液（300g/L）：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。(12)对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95%乙醇中，加水稀释至100mL。(13)乙酸溶液（1mol/L）：量取5.8mL乙酸，加水稀释至100mL。(14)乙酸钠溶液（1mol/L）：称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠，加水溶解后并稀释至500mL。(15)乙酸钠-乙酸缓冲溶液：量取60mL乙酸钠溶液与40mL乙酸溶液混合，该溶液pH为4.8。(16)显色剂：15mL甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇混匀（室温下放置稳定3d）。(17)氨氮标准储备溶液（以氮计）（1.0g/L）：称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后移于100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mg氮。(18)氨氮标准使用溶液（0.1g/L）：用移液管吸取10.00mL氨氮标准储备液于100mL容量瓶内，加水定容至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于0.1mg氮。实验步骤：（1）试样消解称取乳清试样1g～5g（精确至0.001g），移入干燥的250mL定氮瓶中，加入0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20mL水，放冷后移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。（2）试样溶液的制备吸取2.00mL～5.00mL试样或试剂空白消化液于100mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。(3)标准曲线的制备吸取0.00mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL和1.00mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg和100.0μg氮），分别置于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。（4）试样的测定吸取0.50mL～2.00mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4.0mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色杯内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值。2、乳清中乳糖的测定（酶—比色法）原理：在β-乳糖苷酶催化下，乳糖分解为D-葡萄糖和D-半乳糖。己糖激酶将D-葡萄糖酸化成6-磷酸葡萄糖，同时将ATP转化为ADP，受6-磷酸葡萄糖脱氢酶的催化，6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸，同时烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）被还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。在波长340nm处NADPH的吸光度值与乳糖含量成正比，与标准系列比较定量。仪器：（1）分析天平：感量0.1mg。（2）比色管：10mL,带盖。（3）紫外可见分光光度计（4）恒温水浴锅试剂：（1）31g/L亚铁氰化钾溶液：称取3.55g三水亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6].3H2O）溶于水，稀释至100mL，混匀。（2）40g/L硫酸锌溶液：称取7.13g七水硫酸锌溶于水，稀释至100mL,混匀。（3）2mol/L硫酸溶液：将硫酸加入水中。（4）4g/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠，稀释至100mL,混匀，置于乙烯塑料品中。（5）200g/L氢氧化钠溶液：称取20.0g氢氧化钠，稀释至100mL,混匀，置于乙烯塑料品中（6）422g/L硫酸铵溶液：称取42.2g硫酸铵荣溶于水，稀释至100mL,混匀。（7）柠檬酸缓冲液(Ph6.6):称取2.8g二水柠檬酸三钠，0.042g一水柠檬酸和0.625g七水硫酸镁，溶于40mL水中，混匀。用2mol/L硫酸溶液或4g/L氢氧化钠溶液将pH调至6.6,定容至50mL，混匀后放置0℃-4℃冰箱中，可保存3个月，使用前放置至室温。（8）三乙醇胺（TEA）缓冲液（pH7.6）：称取14.0g三乙醇胺盐酸盐，0.25g七水硫酸镁溶于80mL水中，用200g/L氢氧化钠溶液将pH调至7.6，稀释至100mL，混匀后放置0℃-4℃冰箱中，可保存2个月。（9）NADP+-ATP-TEA缓冲液：称取65mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐和170mg5-三磷酸腺苷二钠盐（纯度99﹪-100﹪），溶于水30mL三乙醇胺缓冲液中，混匀后置于0℃-4℃冰箱中，可保存2个周，使用前放置至室温。(10)β-GSL-（NH4）2SO4悬浊液：将β-乳糖苷酶加入422g/L硫酸铵溶液中，使β-乳糖苷酶得活性不低于60IU/mL，缓冲液搅匀成悬浮液后放置0℃-4℃冰箱中，可保存12个月.使用时悬浮液的容器应放入冰水中。（11）HK-G6PDH-(NH4)2SO4：将己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶加入422g/L硫酸铵溶液，使己糖激酶的活性不低于280IU/mL，6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性不低于140IU/mL，缓慢搅匀成悬浊液后放置0℃-4℃冰箱中，可保存12个月.使用时悬浮液的容器应放入冰水中。（12）乳糖标准溶液：称取87℃干燥至恒重的一水乳糖0.842g，精确到0.0001g，溶于水中，定溶至100mL，摇匀。准确吸取1.00mL上述溶液，用水定容至100mL，即得80ug/mL乳糖标准溶液，现用现配。实验步骤：（1）试液制备用分析天平称取2g乳清，加入20mL40℃-50℃热水，搅匀成乳浊状或悬浊液试料，转移至250mL容量瓶。用刻度移液管加入5.0mL亚铁氰化钾溶液，5.0mL硫酸锌溶液和10mL4g/L氢氧化钠溶液，每次加入后均应充分摇匀。定容，混匀，静置30min，过滤，弃去最初滤液约30mL。吸取5.00mL滤液溶于100mL容量瓶中，定容，即为试液。（2）标准曲线的制备用微量移液管吸取0.00,0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL乳糖标准溶液,分别置于10mL比色管中，各加入0.20mL柠檬酸缓冲液，0.05mLβ-GSL-（NH4）2SO4悬浊液，摇匀，与36℃恒温水浴锅中恒温15min。取出后加入1.0mLNADP+-ATP-TEA缓冲液,0.05m/LHK-G6PDH-(NH4)2SO4铵悬浊液，摇匀，于36℃恒温水浴锅中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色皿，以乳糖标准溶液含量为0.00的试剂溶液作参比，在波长为340nm处测得各比色管内溶液的吸光度。以乳糖含量为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。（3）试液的测定用微量移液管吸取1.00mL试液，置于10mL比色管中，加入0.20mL柠檬酸缓冲液，1.00mLNADP+-ATP-TEA缓冲液，0.05mLHK-G6PDH-(NH4)2SO4悬浊液，摇匀，于36℃恒温水浴锅中恒温60min，取出，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀。此溶液即为空白溶液。用微量移液管吸取1.00mL试液，置于10mL比色管中各加入0.20mL柠檬酸缓冲液，0.05mLβ-GSL-（NH4）2SO4悬浊液，摇匀，与36℃恒温水浴锅中恒温15min。取出后加入1.0mLNADP+-ATP-TEA缓冲液，0.05m/LHK-G6PDH-(NH4)2SO4铵悬浊液，摇匀，于36℃恒温水浴锅中恒温60min。取出后，冷却至室温，用水定容至5.00mL，摇匀，放置5min。用1cm比色皿，以空白溶液作参比，在波长340nm处测定比色管内试液的吸光度，在标准曲线上查出对应的乳糖含量。3、乳清中脂类的测定（酸水解法）原理：将样品与盐酸溶液一同加热进行水解，是结合或包藏在组织里的脂肪游离出来，再用乙醚或石油醚提取脂肪，回收溶剂，干燥后称量，提取物的质量即为脂肪含量。试剂：无水乙醇、无水乙醚、石油醚、盐酸（25:11）仪器：(1)电热恒温水浴锅(2)电热恒温干燥箱(3)分析天平(4)比色管（50mL）(5)具塞量筒（100mL）(6)称量皿(7)移液管（10mL）(8)量筒（50mL）实验步骤：(1)称取10.00g样品置于50mL比色管中，加10mL盐酸。(2)将比色管放入70~80℃水浴中，每隔5～10min用玻璃棒搅拌一次，至样品消化完全为止，时间约需40~50min。水解过程中，如水分蒸发，应适当补加水，保持溶液总体积不变，以避免酸浓度升高。(3)脂肪提取：取出比色管，加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移人100mL具塞量筒中，用25mL乙醚分次洗试管，洗液一并倒人量筒中。加塞振摇1min，小心开塞放出气体，再塞好，静置12min，小心开塞，用25mL石油醚一乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置10~20min。(4)带上部液体分层清晰后，读出醚层总体积。(5)准确吸取10mL醚层于已称重的称量皿中，放通风厨中用电吹风使乙醚、石油醚挥发。(6)将称量皿放在98~100℃烘箱中烘至恒重。二、转速对乳清特性的影响取4支离心管分别称取乳清样品5g，分别置于2000r/min，3000r/min，4000r/min，5000r/min的转速下离心15min，取其上清液，按照上述方法分别测出各自蛋白质和乳糖的含量。比较离心前后乳清中蛋白质、乳糖、脂肪含量的变化。三、温度对乳清特性的影响取6支试管，分别称取乳清样品5g置于其中，然后分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的恒温水浴锅中20min，取出后，置于离心管中，在2000r/min的转速下离心15min，取其上清液，按照上述方法分别测出各自蛋白质和乳糖的含量。比较离心前后乳清中蛋白质、乳糖、脂肪含量的变化。四、pH对乳清特性的影响取6支离心管分别称取乳清样品5g，用2mol/L硫酸溶液或4g/L氢氧化钠溶液将pH分别调至4、5、6、7、8、9，在2000r/min的转速下离心15min，取其上清液，按照上述方法分别测出各自蛋白质和乳糖的含量。比较离心前后乳清中蛋白质、脂肪、乳糖含量的变化。五、离子强度对乳清特性的影响分别称取CaCl20.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0g溶于100mL水中，用10支烧杯分别称取5g乳清，用移液管分别取2mL上述CaCl2溶液加入烧杯中，然后置于离心管中，在2000r/min的转速下离心15min，取其上清液，