实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR原理与应用提纲•PCR•定量PCR•荧光化学监测物质•实时荧光定量PCR应用PCR目的及背景多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝.分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。传统PCR传统PCR传统PCR通过凝胶电泳对终产物进行定性分析(30cycles)传统PCRRealityTheoreticalincreaseLogTargetDNACycle#•Intheory,PCRreactionsamplifyexponentially,doublingeverycycleandgrowforever.•Inreality,PCR:理论vs.实际提纲•PCR•定量PCR•荧光化学监测物质•实时荧光定量PCR应用定量PCR通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析模板Cycle12X模板4X模板30-40循环Cycle2荧光检测FFFFFFFF荧光监测化学物质LogViewLinearView本底期、指数扩增期、平台期•荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)•Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04荧光阈值与Ct值108标准曲线106108标准曲线104108106标准曲线108106102104标准曲线108106102104T标准曲线标准曲线108106102104T标准曲线105copies/well标准曲线定量PCR优点定量：对初始模板的绝对定量优点：更灵敏，宽广的动力学范围污染机会少：闭管化学没有后处理：不用杂交、电泳、拍照操作简单：高度自动化用途广泛：既能定量又能定性灵活：既可多点测定，又可单点测定提纲•PCR•定量PCR•荧光化学监测物质•实时荧光定量PCR应用非特异性标记SYBRGreenIEvaGreen荧光化学物质特异性的荧光探针TaqMan分子信标(Molecularbeacons)SYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenI使用方便，只需要一对引物－－不必设计复杂的荧光探针熔解曲线－－鉴定PCR有无杂带、引物二聚体便宜灵敏无模板特异性－－不能分辨非特异产物不能做复合PCR扩增融解曲线反应程序1、融解曲线在定量PCR反应完成之后2、软件自动分析结果，生成融解曲线图谱融解曲线分析-原始图谱融解曲线分析-导数图谱TAQMAN探针TAQMAN探针TAQMAN探针对目标序列有很高的特异性---特别适合于SNP检测可以在一个反应中进行两个基因的定量荧光强度与反应物成正比反应成本较高设计复杂TaqMan探针小结提纲•PCR•定量PCR•荧光化学监测物质•实时荧光定量PCR应用定量PCR应用I-实时定量–病原体定量检测–转基因拷贝数的检测DNA定量－拷贝数研究（替代SouthernBlot）RNA定量－基因表达差异（替代NorthernBlot)单个或多个基因地表达谱分析–不同组织、器官–不同时期–不同处理定量PCR应用II：终点读板•基因突变分析–单基因遗传病诊断，如血友病、地贫•SNP扫描–疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定–SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异–药物副反应的预防，如麻醉意外•物种鉴定、菌株鉴定–各种病毒，细菌，病毒–病原体检测，如炭疽菌，Ecoli.O157