人工结合抗原制备

人工结合抗原制备20130805•抗原——是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。•抗原的基本特性：①诱导免疫应答的能力，即免疫原性。②与免疫应答的产物发生反应，即抗原性（免疫反应性）。免疫原——具有免疫原性的物质免疫原性的化学基础化学组成分子量化学结构大分子蛋白、多糖等﹥10000具有免疫原性；4000﹤免疫原﹤10000呈弱免疫原性；4000﹤一般不具有免疫原性。一般而言，分子结构和空间结构愈复杂的物质免疫原性愈强人工抗原•人工抗原：用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。•①人工结合抗原：将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联，或将无免疫原性的有机分子如二硝基苯（DNP）或三硝基苯（TNP）与蛋白质载体结合，形成载体-半抗原结合物，均属人工结合抗原。•②人工合成抗原：用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽（PLL）。•③基因工程抗原：将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体（如细菌粒或病毒）DNA分子相结合，然后引入受体细胞中（如原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞）使之表达，即能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后可做为疫苗，此即基因工程疫苗。人工结合抗原半抗原：能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质（如青霉素、磺胺剂等），称为简单半抗原。载体蛋白：制作人工结合抗原时与半抗原进行偶联的具有免疫原性的生物大分子，主要为大分子的蛋白质。如：牛血清白蛋白(BSA)。载体蛋白半抗原偶联桥半抗原选择合适的多肽序列，蛋白质的抗原决定簇一般由6-12个氨基酸构成，呈连续性或者非连续性序列。抗原决定簇大部分为亲水性基团，暴露在外侧，抗原决定簇柔韧性比较高。制备性抗原地多肽有效长度一般是10-20个氨基；334Da﹤半抗原的分子量﹤374Da制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。﹤300Da产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。确定抗原性区域亲水性、表露性、柔韧性确定多肽的长度半抗原人工抗原合成常用的载体载体表面应首先应具有化学活性基团。载体应具备一定的容量，可以偶联足够的分子。载体应该是惰性的，不应干扰偶联分子的功能。载体应具有足够的稳定性，且应该是廉价易得的。牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等是常用的载体蛋白。载体的特点蛋白偶联方法一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法。所有的偶联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。缓冲液成分及其纯度和离子强度、PH偶联剂的有效浓度偶联物的浓度偶联剂相对量偶联物相对比例半抗原的稳定性、可溶性、理化特性偶联效果通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合，不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行。蛋白偶联方法•分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联•①混合酸酐法（mixedanhydridemethod），又称氯甲酸异丁酯法正丁胺-COOH-中间体+NH3+结合产物+氯甲酸异丁酯•②碳二亚胺法(EDC)半抗原载体蛋白酰胺键酰胺键EDC蛋白偶联方法•含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联•①戊二醛法-N=C（schiff键）•②重氮化法（用于活性基团是芳香胺基的半抗原）芳香胺基+NaNO2+HCl重氮盐蛋白偶联方法•含羟基半抗原的偶联•①琥珀酸酐法-OH-+琥珀酸酐无水吡啶带有羧基的中间体EDC法或混合酸酐法结合产物•②羰基二咪唑法（CDI）N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂方法举例（EDC法实验步骤）mTP5mgcBSA2.5mgTEbuffer（pH8.0）250μlEDC·HCl79mg充分溶解于250μlTEbuffer（pH8.0）37℃摇床中反应2hSephadex柱0.5ml溶液在PBS中透析3d透析产物小剂量分装，于－20℃保存备用影响人工抗原质量的因素偶联比（联接到蛋白质分子上的半抗原数目）连接到蛋白分子上的半抗原数以5-20为宜，为了取得最佳免疫效果，应逐个确定各种载体的最佳结合比。偶联桥结构简单，能量低，直链，有助于半抗原暴露在外面最好3-6个直链的碳原子结构半抗原的分子空间结构最好有分支结构，最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后筛选。人工抗原的质量评定•浓度测定紫外吸收法、福林酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法等。•纯度鉴定和结构分析紫外光谱扫描法电泳技术鉴定是否达到电泳纯