荧光定量数据分析

定量PCR：数据处理报告人：丁达[e-mail]材料来源：陈云地博士（美国应用生物系统公司技术专家）2™定量PCR的实验要素™定量PCR的实验目的™定量PCR的数据处理内容提要定量PCR的实验要素4¾目标基因未知样品¾产生标准曲线标准品¾监控试剂、系统阳性对照¾监控污染阴性对照¾数据之间可比性内对照(IPC)¾校正操作误差参比荧光(ROX)¾降低定量误差3-6复管定量PCR实验要素596-孔板设置举例标准品未知检材阳性对照阴性对照6DNA样品‹模板可以是DNA、cDNA或者质粒‹RNA需要先反转录成cDNA；反应只能以cDNA为模板，但是可以通过标准曲线或者相对定量直接定出RNA的数量或者比例‹DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6~2.0之间=1.8:纯DNA2.0:RNA污染1.6:蛋白质/酚污染‹DNA用量：基因组DNA：0.1ng–1ug，昀好10-100ng/rxn‹来源：血样、组织等‹自己制备（血样：如蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提，酒精/NaAc纯化）7RNA样品‹RNA用量：60ng–2ug/RT-rxn；‹RNA纯度：OD260/OD280=2.0‹来源：血样、组织、病毒等‹反转录：100uL的反应体系可以将昀多2ug总RNA反转录成cDNA；如果总RNA2ug，分开做复管‹cDNA用量：1-100ngRNA反转录所得cDNA加1uL/rxn8标准品的要求‹标准品用来生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系‹不要求：‹数学关系是抽象的、普适的，不要求标准品与目标基因一定具有相同的生物学意义‹所以，同一个片段可以使用，不是同一个片段也可以使用‹任何DNA片段，PCR产物、质粒、病毒的PCR片段等均可‹要求：‹浓度已知‹PCR效率尽量接近，越一致误差越小‹同样条件下完成：同样的仪器、试剂、循环参数、同一次实验‹同样质量的模板、同样Tm值的引物和探针)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC+−−++−=9PCR效率对定量结果的影响N:numberofamplifiedmoleculesN0:initialnumberofmoleculesn=30E=1.95N=N0(1.95)30=N0x5.0x108n=30E=1.90N=N0(1.90)30=N0x2.3x108n:numberofamplificationcyclesE:amplificationefficiency相差2.2倍10PCR扩增效率的测定E=10-1/斜率11梯度稀释方法‹5点以上，已知浓度（相对定量）/拷贝数（绝对定量）‹购买，或者自己制备‹制备方法：选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释‹CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间‹10倍连续梯度稀释操作方法：取1v标准品原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii取1v稀释的标准品(标准品ii)+9v稀释缓冲液，得标准品iii取1v稀释2次的标准品(标准品iii)+9v稀释缓冲液，得标准品iv取1v稀释3次的标准品(标准品iv)+9v稀释缓冲液，得标准品v切不可由标准品i加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v12标准品单位问题‹标准品的性质决定昀终结果的性质：DNA标准品，已知拷贝数→绝对定量，得未知样品拷贝数DNA标准品，已知ng/uL→绝对定量，得未知样品ng/uLDNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数→相对定量，得未知样品之间相差倍数RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA→相对定量，得未知样品ngRNA/uL‹注意测定对单位的要求如果要求测定样品的基因拷贝数，→梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比）13I1000I2000I4000I8000I16000I32000Amounts.(pg)20-19-18-17-16-15-CT••••••••••••••••••••••••⊗A⊗B⊗CTargetgene⊗A⊗B⊗CEndogenouscontrolEndogenouscontrolRelativeStandardCurveComparisonofthec-mycexpressionlevelinbrain,kidney,liverandlungStandard:RajiCelllinetotalRNAEndogenousControl:GAPDH要做几条标准曲线？14阳性内对照‹实验操作一般以uL为单位取样‹由于DNA抽提效率不同和操作误差‹同样体积的DNA并不来源于同样数目的细胞‹copy/uL要校正成copy/cell才有比较意义‹[Copy/uL]/[cell/uL]=copy/cell‹选用管家基因作IPC，其基因数正比于细胞数[CopySmpl]/[CopyIPC]=CopySmpl/cell或者∆CT=CTSmpl-CTIPC管家基因—IPC15IPC的定义••什么是什么是IPC?IPC?IPC通常指一段管家基因序列，它与目标基因在相同PCR条件下具有相似的扩增效率；通过不同荧光标记的探针区分。••IPCIPC的作用的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。16内对照的选择标准1.EndogenousControlisconsistentlyexpressinthesamplesetstobetested2.Considerwhetherthegeneselectedistissuedependent,developmentstagedependent,ortreatmentdependent3.Ifmultiplexingthereaction,geneexpressionleveloftheendogenouscontrolshouldbegreaterthanthatofthetarget4.TestwithHumanEndogenousControlPlate(P/N4309920)常用的内对照：18SrRNA、β-actin、GAPDH17目标基因与内对照基因扩增效率非常接近曲线斜率0.118以固定的浓度存在于PCRMasterMix中不参与扩增，信号强度只与取用多少有关Mix加得多一些，信号就强一些；加得少一些，信号就弱一些消除用枪操作误差、管盖厚度等光学误差减少孔间、批间差异，提高数据重现性和精确度阳性参比荧光“管家荧光”—ROXRn=RReporter/RROX19ROX校正方法报告荧光报告荧光((R)/R)/参比荧光参比荧光((Ref.)Ref.)==FAMFAM//ROXROX,,VICVIC//ROXROXReporterReference20TaqMan数据的ROX校正ROX校正前β-actinTaqMandataROX校正后21区分5,000和10,000拷贝的2倍差别(模板差2倍=CT值差1个循环)SYBRGreen数据的ROX校正ROX校正前ROX校正后22判断有无引物二聚体及非特异性扩增产物熔解曲线的ROX校正ROX校正前ROX校正后23重复样品‹遵循统计学要求，可以降低定量误差，提高数据可信度‹小样本统计，n6‹n6时，计算出来的标准偏差没有意义‹未知样品、标准品和对照都要重复‹所有复管在同样条件下完成定量24阳性对照和阴性对照‹阳性对照‹已知必定可以成功、得到扩增曲线的样品‹用于判断仪器、试剂、操作是否存在问题（假阴性）‹如果有标准品，可以兼做阳性对照，省略专门的阳性对照‹阴性对照/空白对照‹除了模板DNA或RNA，具备其他全部成分‹或者以水代替‹用于判断系统是否存在污染（假阳性）阳性阴性假阴性假阳性定量PCR的实验目的26两种定量绝对定量相对定量“600个拷贝”“增加10倍”27绝对定量与相对定量的区别•绝对定量–优点：给出的是目标基因的绝对数量，数据容易处理–缺点：必须有标准品；标准品必须准确测定，难以制备和质控•相对定量–优点：可以不做标准品；标准品容易制备；使用广泛–缺点：数据理解困难500010000010002000300040005000600070008000900010000Sample1Sample2Copy#1200.250.50.7511.251.51.752Sample1Sample2FoldChg绝对定量目标：确定样品中目标基因的准确拷贝数20,000copies10,000copies5,000copies2500copiesUnk1Ct=24.8Unk1Conc=4000copies1250copies相对定量通过标准曲线，比较基因的相对含量，不需知道拷贝数由同一个标准品梯度稀释而成Unk1Conc=4x103pgtotalRNAUnk2Conc=2x103pgtotalRNA2-folddifference2x104pgtotalRNA1x104pg5x103pg2.5x103pgUnk1Ct=24.81.25x103pg定量PCR的数据处理31误差的校正•模板方面的误差：IPC校正取样量即细胞数量、抽提效率、纯化损失、反转录效率等•操作误差：ROX校正试剂取用误差的主要部分、受耗材质量及仪器等影响而产生的荧光激发波动•其余误差：统计校正重复实验，取平均值32•NormalizationGene(内对照基因)–其表达水平是恒定的(需要用户自己确认)–校正模板在核酸数量上的差异•CalibratorSample（基准样品）–得出相对于某一个样品的基因表达量,1Xsample.–Treatedvs.Untreated,0hrvs.6hr,Normalvs.Diseased….数据的归一目标基因内对照基因处理后处理前比如ILIL--2218S18SSampleCalibrator比如33••••••••••••I3,125I6,250I12,500I25,000I50,000I100,000Absoluteamount.(copies)←EXACTscale20-19-18-17-16-15-CT⊗A⊗B⊗CCT161819Absoluteamount50,000copies12,500copies6,250copiesSampleASampleBSampleC绝对定量举例通过CT值测定起始DNA量34相对定量有两种方法相对定量：比较同一基因在不同样品中的表达量高低，数据是%，没有单位。ƒ标准曲线法或者∆∆CT法ƒ应用最广泛功能最强大ƒ样品可以是DNA或者RNAƒDNA或者RNA都可以用来制备标准曲线ƒ需要ROX校正加样操作的误差ƒ需要管家基因校正细胞数误差35相对定量：标准曲线法0.25(~4folddecrease)2.551CalibratedIL-2Expression0.50x10-25.1x10-22.0x10-2NormalizedIL-2Expression40423201032IL-2pgtotalRNA80,17624Hr45,1232Hr52,1520Hr18SpgtotalRNA36∆CTameasureoftheratioofonetargettoanother相对定量：∆∆CT法∆∆CT=∆CTUnknown-∆CTCalibratorNormalizedUnknown相当于Normalizedcalibrator37N=N0×(1+E)nN:扩增产物数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数荧光信号理论方程Rn=RB+N0(1+E)nRs总信号=本底信号+分子数量×单位信号强度Rn第n个循环时的总信号RB背景信号RS单位信号强度N0起始DN