VENTANA ALK (D5F3) 免疫组化检测在非小细胞肺癌中的新进展-3.10 KINGMED

VENTANAALK免疫组化检测在非小细胞肺癌中的新进展罗氏诊断组织诊断部勾红菊罗氏公司简介肺癌生物学概览ALK检测方法VENTANAALK(D5F3)免疫组化检测在NSCLC中的运用总结•1896年成立于瑞士巴塞尔•全球员工约有85000人•业务遍布全球五大洲170个国家•2014年实现348亿瑞士法郎销售•全球500强公司（2014年排名196位）•连续5年（2011-2015）被评为“中国最佳雇主”主营业务:药品及诊断•全球第一位的体外诊断公司•全球第一位的免疫组织化学及原位杂交诊断公司•全球领先的肿瘤药物公司1926年进入中国罗氏公司简介罗氏在个人化治疗的独特优势两大支柱超过40个合作伙伴--188个合作项目全面的产品伴随诊断的先驱罗氏产品贯穿病理科测试流程前处理常规染色高级染色图像/报告工作流程1)追踪2)取材3)固定4)处理1)二进制诊断2)组织形态1)诊断2)目标分子检测3)预测/预后1)定量分析2)生出报告3)远程病理4)图片归档SymphonyBMKSSBenchMarkGX/XT/ULTRAiScanCoreo/HT罗氏产品工作流程与连接原位杂交免疫组化VANTAGE图像分析组织预备特殊染色H&E染色罗氏公司简介肺癌生物学概览ALK检测方法VENTANAALK(D5F3)免疫组化检测在NSCLC中的运用总结中国肺癌现况中国死亡率分布图•在中国，肺癌已成为死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌每年新发病例65万人•在中国，肺癌5年存活率大约16.1%，其中85%以上是非小细胞肺癌（NSCLC）Apopulation-basedstudy,Int.J.Cancer:00,00–00(2014）NSCLC分期70%患者发现时处在晚期（III期以上），只能进行化疗检测仅能通过细针穿刺或胸水等获取小组织或细胞进行进一步检测非小细胞癌（NSCLC）腺癌约65%其它约10%鳞状细胞癌约25%NSCLC组织学分类NSCLC分子遗传学分类NSCLC占肺癌患者85%以上，其中肺腺癌占NSCLC的约65%根据病理类型以及分子表型细分肺癌亚组，是目前临床个体化治疗的决定性因素肺癌的基本诊断流程小细胞肺癌非小细胞肺癌肺腺癌肺鳞癌大细胞肺癌生物标记检测EGFRmutationsEML4-ALKROS1,C-METB-RAF…….NoEGFRTKi*EGFRTKi(Tarceva)Crizotonib(Xalkori)TTF-1,NapsinA,CK7，CK20H&EIHCSISHFISHMolecularKRAS肺癌P40,P63,CK5/6肺非小细胞癌EML4-ALK基因重排•EML4(echonodermmicrotubul-associatedprotein-like4)•棘皮动物微管相关类蛋白4，•于2007年发现EML4与ALK(anaplasticlymphomakinase)间变性淋巴瘤激酶发生基因重排EML4EML4–ALK变异体1HELP1496981WDBasic14961059110581620TM激酶ALKEML4和ALK基因反向分布于2号染色体短臂，EML4发生到位後，与ALK发生融合，形成EML4-ALK融合基因罗氏Ventana简介肺癌生物学概览ALK检测方法VENTANAALK(D5F3)免疫组化检测在非小细胞肺癌中的运用总结ASCO，CAP,IASLCandAMP关于肺癌患者的分子检测指南检测对象•腺癌或含腺癌成分的肺癌（无论组织学分级）切除标本。无任何腺癌成分[单纯鳞癌、单纯小细胞肺癌和缺乏免疫组化（IHC）证实腺癌分化的大细胞肺癌]的完整肺癌切除标本无须检测•肺腺癌和混合种类亚型:EGFR和ALK检测用于选择初始治疗方案,诊断晚期肺癌,早期肺癌复发,以及原位和转移病灶的鉴别检测时机•组织样本优先做EGFR和ALK的检测•I,II,III期鼓励患者行EGFR&ALK，IV期适合治疗的患者NatashaB.Leighletal.JOURNALOFCLINICALONCOLOGY.32.©2014byAmericanSocietyofClinicalOncologyFISHRT-PCRIHCALK检测方法历史荧光原位杂交(FISH)•采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开•≥15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果（计数50cells)。•暗场视野操作，需荧光显微镜•EML4-ALK的位点在二号染色体上相对靠近,当发生染色体内倒位时，FISH的信号就会发生改变以至难以判读，可能出现假阴性*•约5%-11%的细胞会出现假阳性分离**野生型ALK重排*Yingetal.AnnalsofOnc24:2589-2593,2013**VarellaGarciaetal.,IASLC2011;Abs#MTE36.12•因引物特异性，不能检测ALK融合基因的未知亚型•对引物的要求高，需要多条引物•RNA提取需要较多，石蜡组织样本且易降解•对实验室要求较高，需要PCR实验室资质逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)ASCO不推荐RT-PCR作为ALK重排检测方法学常规IHC–ALK检测•常规IHC-ALK检测因抗体，检测系统的差异性导致灵敏度不高•缺乏规范化的操作流程与评分系统缺乏结合临床数据的支持，无明确判读标准01+2+3+IHC评分IHC和FISH结果相关的最新数据汇总IHCFISH0阴性1+不明确–需要进一步验证2+不明确–需要进一步验证3+阳性Mitsudomietal.,ASCO2011;Abs#7534Parketal.,IASLC2011;Abs#O05.07罗氏公司简介肺癌生物学概览ALK检测方法VENTANAALK(D5F3)免疫组化检测在非小细胞肺癌中的运用总结VENTANAALKIHC检测•在2013年8月，罗氏/VENTANA用于识别肺癌患者ALK蛋白表达的首款全自动免疫组化(IHC)伴随诊断获得中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准。可用于筛选适合服用辉瑞制药有限公司的赛可瑞®的患者。国食药监械(进)字2013第3402824号中国肺癌诊断专家共识一致认可VENTANAALK兔单克隆阴性抗体NSCLCALK（+）或阑尾组织VENTANAALK(D5F3)兔单克隆抗体BMK染色仪增强DAB+扩增盒ALK(D5F3)抗体其他标志物检测?•BenchMark平台全自动染色－流程标准化•检测系统经过CE/IVD、CFDA认证•阳性结果可直接接受克唑替尼治疗罗氏/VENTANAALKD5F3与徕卡ALKD5F3及ALK5A4的对比ALKD5F3ALKD5F3ALK5A4罗氏徕卡徕卡抗体+试剂盒+染色系统=准确的检测结果!为什么要用增强DAB和信号放大试剂盒?目标:建立一个二元判读方法(阳性或阴性)*~20%ALK阳性病例蛋白表达比较弱,一般的DAB试剂盒无发检测出来.FISH阳性病例FISH阳性病例VENTANAALKIHC(D5F3)检测系统系统对照•阳性对照：ALK阳性NSCLC组织或良性阑尾•阴性对照：兔单克隆阴性对照抗体•每一轮都必须设置系统对照，以评估机器或试剂等等因素可能引起的假阴性或假阳性；只有当系统对照染色可接受时，本轮实验结果方能采信染色可接受染色不可接受阑尾组织中神经节细胞出现强的颗粒状胞浆染色阑尾组织中神经节细胞缺乏强的颗粒状胞浆染色腺状上皮、肌肉、淋巴组织中未见强的颗粒状胞浆染色腺状上皮、肌肉、淋巴组织中出现过多的非特异染色阑尾系统对照染色评估表VENTANAALKIHC(D5F3)检测系统样本要求•10%NBF固定石蜡组织（6h固定时间24h)•样本来源：手术样本，细针穿刺，支气管镜活检，胸水痰液等（需制作成细胞蜡块）•切片厚度约4微米，推荐使用正电荷载玻片，切片室温保存不超过3个月非小细胞肺癌中ALK状态测定的评测标准临床判读VENTANAALKIHC染色说明ALK阳性肿瘤细胞中存在强的颗粒状胞浆染色(任何百分比的阳性肿瘤细胞)。应当排除已知的染色元素，包括：•肺泡巨噬细胞中较淡的胞浆点状染色，•神经来源的细胞(神经细胞和神经节细胞)，•腺状上皮染色，以及•浸润的淋巴细胞。非小细胞肺癌中正常粘膜(包括粘蛋白)内以及坏死组织区域内也可见到一些背景染色，这些也应从临床评估中排除。ALK阴性肿瘤细胞内不存在强颗粒状胞浆染色。VentanaALK(D5F3)的CFDA注册临床实验•三家公立医院（上海肿瘤医院，中国科学院肿瘤医院，北京大学人民医院）超过1100例NSCLC样本进行VENTANAALK(D5F3)与FISHALK结果的对比验证实验•结果表明VENTANAALK(D5F3)与FISHALK的一致性为99.23%泛欧洲VENTANAALK检测判读一致性研究MulticenterImmunohistochemicalALK-TestingofNSCLCShowsHighConcordanceafterHarmonizationofTechniquesandInterpretationCriteria.vonLaffortetal.JournalofThorancicOncology.2014.Vol.9•来自比利时、德国、丹麦、法国、苏格兰、西班牙、瑞典和瑞士的16家科研单位•两块组织芯片(15个非小细胞肺癌病例其中12例腺癌)•FISH结果:6例ALK阳性，7例ALK阴性，2例不太确定（10~15%cut-off）•研究办法：所有实验室均进行VENTANAALK标准化检测，并通过VENTANA判读培训•最终结果：16个实验室对15个病例的VENTANAALK判读100%一致，包含2例FISH不确定样本(VENTANAALK为阳性）研究表明：VENTANAALK免疫组化方法是检测ALK阳性肺癌患者的可靠方法，具有极高可重复性•RedefingCriteriaforALK-positiveLungCancerCamidgeetal.,Cancer2013;119:3968-3975–8.5%的FISHALK不确定(介于10-15%cut-off)患者可能存在ALKIHC阳性–复杂罕见的FISH信号模式（通常判定为FISHALK阴性）建议用替代方法进一步验证•AccurateandEconomicalDetectionofALKPositiveLungAdenocarcinomawithSemiquantitativeImmunohistochemicalScreening.ZhouJetal.PLoSONE(2014)9(3):e92828.–越来越多的文献支持存在FISH阴性，ALKIHC阳性的患者仍可能通过克唑替尼治疗获益.•ALKTestinginNon-SmallCellLungCarcinoma:WhatNow?KeithM.etal.JournalofThoracicOncology.Vol9,May2014.–克唑替尼作用于异常表达的融合蛋白，而非重排的DNA，目前已存在FISHALK阳性而ALKIHC阴性患者对克唑替尼无应答的文献报道。这可能是克唑替尼在FISH,RT-PCRALK阳性的患者中的响应率只有53%~65%的原因之一–ALKIHC可能会成为ALKTPI获益人群筛查的主要生物标记FISH与ALKIHC的临床研究FISH与ALKIHC的临床研究•对103例经FISH验证过的NSCLC患者进行VENTANAALK检测•7位不同病理专家在未知FISH结果情况下对VENTANAALK结果进行判读•最终与FISH相比准确率为93%；灵敏度为90%，特异性为95%NCCNNSCLC2015v1因此项研究肯定了VENTANAALKIHC可以用在NSCLC中ALK状态的快速检测NordiQC质控评分–2013年底(D5F3)RTUAb使用试剂盒推荐的检测程序，通过率为100%ALK(D5F3)浓缩型Ab使用非VENTANA检测系统，通过率仅为83%罗氏Vent