5种制备siRNAs的方法 - 首都师范大学精品课程网

siRNAdesignRNAi用途&5种制备siRNAs的方法：•体外制备：化学合成体外转录用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA•体内表达：siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAsPCR制备的siRNA表达框在细胞中表达1.化学合成•highquality,chemicallysynthesizedsiRNAsonacustombasis.•thelargeyieldofhighpuritysiRNAobtained.•mostexpensiveBestfor:已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究Notsuitablefor:筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素•体外转录是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。•这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果Bestfor:筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。Notsuitablefor:实验需要大量的，一个特定的siRNA，长期研究。2.体外转录•选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA•RNaseIII(orDicer)在体外消化，得到一众siRNAs•除掉没有被消化的dsRNA•siRNA混合物直接转染细胞3.用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA体内表达采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。siRNA表达载体siRNA表达框架(SECs)siRNA表达载体•多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种•siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。siRNA表达框架(SECs)siRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。例如在抗肿瘤治疗中，RNAi可用于抑制癌基因的表达；或者利用RNAi的高度特异性敲除点突变激活的癌基因；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达；还可用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子VEGF或多药耐药基因MDR）的表达。在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒。RNAi用途•C/EBPs是生物体内重要的转录因子，迄今已报道的C/EBPs有6类，其中，人类的C/EBPβ又称NF-IL6，是C/EBPs家族中的一个重要成员。研究发现，NF-IL6经常在某些肿瘤细胞系如乳腺癌、皮肤癌等中过表达，因此，降低NF-IL6的表达水平，可能成为肿瘤治疗的重要途径。•采用特异设计的针对NF-IL6mRNA的siRNA，与能特异表达siRNA片段的质粒进行重组后感染人乳腺癌瘤细胞MCF-7，以研究RNAi技术能否特异性抑制MCF-7(中转录因子NF-IL6基因的过表达，从而为肿瘤的基因治疗提供新的方法和实验基础。•构建能够沉默转录因子NF-IL6表达的小干涉siRNA质粒，转染肿瘤MCF-7细胞后，用Western印迹法和荧光素酶活性实验检测NF-IL6表达水平和转录活性的改变。结果发现NF-IL6的表达水平被下调80%，转录激活能力降低了60%，转染细胞内部出现大量空洞，细胞增殖停滞。•推测可能是因为NF-IL6基因被抑制后，与细胞增殖及形态维持相关的基因表达失控，从而使MCF-7细胞增殖受到影响，因而预示着对NF-IL6的siRNA干涉可治疗癌症。肿瘤方面的研究：•RNAi用于肿瘤发生及侵袭转移相关基因功能的研究•RNAi用于肿瘤密切相关的信号传导通路的研究•RNAi用于肿瘤的治疗性研究……前景与展望•RNAi为抗肿瘤、抗病毒及遗传病等的基因治疗带来了新的希望,也为基因功能研究提供了强有力的工具。•但目前也存在一些问题:①RNAi的作用机制尚不很清楚,使RNAi的广泛深入应用受一定影响。②针对哺乳动物细胞的siRNA设计和筛选有很大的盲目性,需经过反复试验才能筛选出有效作用位点,在理论和技术上有待突破。③有些mRNA的靶序列与蛋白质紧密结合成复合物,被蛋白质封闭了其作用位点。④与其他基因治疗一样,制约RNAi技术治疗疾病有2个严重的问题,其一是效率低下的载体系统,其二是人们对基因功能认识的广度和深度远不能满足应用的需要,还须在理论与技术的源头上作长久不懈的努力。由于RNAi独特的作用机制,使其抑制靶基因表达的效率远高于反义核酸技术,又由于RNAi技术流程简便,周期短,因此RNAi有可能代替反义核酸技术及基因敲除技术而成为基因功能研究的主力军，在基因治疗方面也显示出诱人的前景。