基因工程的基本操作步骤

1、基因工程包括哪些步骤？3、基因工程中的核心环节是哪一步？4、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？5、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？如何检测和鉴定？2、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？思考讨论问题：基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定主要是指编码蛋白质的基因(一）目的基因目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。一、目的基因的获取（二）获取目的基因的方法1、从基因文库中直接获取2、PCR技术扩增3、化学方法直接人工合成1、从基因文库中直接获取（1）基因文库的概念部分基因文库：基因组DNA文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库含有一种生物的全部基因只包含了一种生物的部分基因，如:cDNA文库（2）基因文库的建立方法提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与运载体连接导入受体菌中储存基因组文库方法一：直接分离法某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与运载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶方法二：反转录法--cDNA的合成流程图解PCR技术—多聚酶链式反应PCR扩增仪DNA半保留复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA2、利用PCR技术扩增目的基因原理：前提：条件：利用PCR技术扩增目的基因5’3’G—GT—C3’5’A—GC—C5’3’引物ⅡG—G高温变性低温退火中温延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；5’3’A—G引物Ⅰ2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成3、人工合成——核心二、基因表达载体的构建功能：使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。基因表达载体的构建1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。编码区非编码区非编码区启动子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。终止子编码区非编码区非编码区启动子终止子AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCG基因表达载体的组成：b、目的基因a、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点1、下列属于获取目的基因的方法的是①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥小试牛刀2、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。(1)此图表示的是采取__________合成基因的方法获取__________基因的过程。(2)图中①DNA是以为__________________模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。人工目的控制胰岛素合成的信使RNA小试牛刀(3)图中③代表，它往往含基因，以便对目的基因的检测。重组DNA分子标记•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞的方法1、农杆菌转化法2、基因枪法3、花粉管通道法土壤农杆菌转化法示意图将目的基因导入动物细胞的方法显微注射法将目的基因导入微生物细胞方法宿主细胞（大肠杆菌）感受态细胞（大肠杆菌）Ca2+四、目的基因的检测与鉴定首先：其次：最后：还要：要检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因DNA分子杂交技术分子探针检测目的基因是否转录出mRNA检测目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平的鉴定不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。3．（2010江苏高考，27题，8分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有个游离的磷酸基团。0、2（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是。（4）与只使用EcoRI相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。高SmaⅠ破坏质粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化DNA连接鉴别和筛选含有目的基因的细胞蔗糖为唯一含碳营养物质