植物抗病基因工程的基本原理与方法

第六章植物抗病基因工程的基本原理与方法植物抗病基因工程是通过分子生物学技术获得对植物病害（病毒、细菌、真菌、线虫等病害）具有一定抗性的转基因植株。►1983年首例转基因烟草问世。►1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花等获得批准进行商品化生产。目前，国内外已报道的转基因作物有16种70多个品系。►自1986年3月以后，我国已研究的转基因作物47类，涉及的转基因103种。正式公布的转基因作物：棉花、大豆、西红柿、青椒和矮牵牛。►目前，已经商品化的转基因作物所转入的外源基因主要是抗性基因，只有少数是改良作物品种性状的。1植物抗病基因工程策略1.1导入植物抗病相关基因和病原菌致病相关基因在植物抗性基因的利用方面◆根据已有的R基因结构特征，设计新的R基因。◆异源表达R基因。◆向同一株植物中导入多个R基因。在病原菌无毒基因的利用方面◇转病原菌无毒基因。◇将病原菌无毒基因和相应的R基因一起导入植物。◇导入与植物抗病信号有关的基因。1.2导入植物防卫基因◆Broglie(1991),etal.在克隆菜豆几丁质基因的基础上将CH5B基因修饰改造，通过Ti质粒转化烟草，获得几丁质酶高效表达的转基因植株，具有协同拮抗枯萎病菌的效果。◆M.J.Carmona(1993),etal.，将来源于大麦基因组克隆的硫素基因和来源于小麦cDNA克隆的硫素基因转化到烟草中，获得了对P.s.pv.tabaci具有较高抗性的植株。◆美国孟山都（Monsanto）公司将真菌编码葡萄糖氧化酶基因导入马铃薯中，获得了对Ecc引起的细菌性软腐病具有良好抗性的植株。1.3导入降解病原物致病因子基因◆H.Anzai(1989),etal.分离到了抗烟毒素（tabtoxin）的基因ttr，将基因ttr与CaMV35S启动子融合成嵌合基因，通过农杆菌介导的转化法转入烟草，获得ttr高表达量的转基因植株，对烟毒素和病原菌的侵染均表现出良好的抗性。◆菜豆毒素（phaseolotoxin）是一种非寄主专化性毒素，产菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通过argK基因合成一种不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，从而对该毒素不敏感。将argK基因导入烟草和菜豆，获得的转基因烟草和菜豆对P.s.pv.phaseolicola有较高的抗性。1.4导入其它蛋白基因◆贾士荣,等(1993)和M.Hassan(1993),etal.向马铃薯导入cecropin基因后提高了马铃薯对青枯病的抗性。◆J.M.Jaynes(1993),etal.将cecropinB基因导入烟草后获得的转基因植株，提高了其对R.solanacearum引起病害的抗性。◆黄大年,等(1997)将cecropinB和cecropinD基因导入水稻幼胚，获得的转基因水稻植株可明显地提高对水稻白叶枯病的抗性，同时也获得了高抗水稻条斑病和水稻白叶枯病的高抗品系。2植物抗病基因工程的技术环节◆至今已分离的供植物基因工程应用的目的基因有100多个，其中研究得比较多的是抗病毒、细菌和真菌的基因，能杀死害虫或使害虫拒食的基因，能抵抗各种除草剂的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高温盐碱等的基因，能提高植物体中蛋白质含量或蛋白质品质的基因等等。这些基因中有些是来自植物本身，有些来自微生物，还有少数是人工合成的。2.1目的基因的分离和鉴定◆对已知序列进行分子克隆◆从蛋白质到基因序列PCR扩增构建cDNA文库构建基因组文库◆与已知基因紧密连锁基因的分离◆根据植株或细胞表型变异进行基因分离转座子标签法图位克隆法基因挽救技术基因组相减法cDNA差式显示转座子导入细胞目的形状突变株构建核DNA文库用转座子序列作探针进行杂交分析转座子两侧序列并以此作探针野生型细胞核DNA构建核DNA文库完整的目的性状基因转座子标签法流程图2.2表达载体的构建◆目的基因分离后，往往需要经过修饰才能应用于植物基因工程。构建植物表达载体就是在目的基因的5’端加上启动子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表达，充分发挥其功能。加入启动子区目前植物基因工程中外源基因常选用的启动子主要有3类：第一类是从Ti质粒的T-DNA序列上分离的启动区。具有真核生物转基因起始所需的TATA盒和CAT盒；第二类是CaMV的35S和19S启动子；第三类是从植物本身分离出来的启动子。加入转录的加尾序列真核生物为保证一个结构基因表达完全末端需要有一个加尾序列。其功能一方面保证转录的终止；另一方面保证形成有活性的mRNA链。植物基因工程中常用的加尾序列是AATAAA。插入内含子内含子是真核生物基因组结构的特点之一。在基因工程中，多数不用在目的基因中插入这种片段就能得到有效的表达，因此，认为它是基因产物功能非必需的。但是在实际操作中，如果在目的基因适当的位置插入这种序列，其表达量可以提高几十到几百倍。因此，有人推测，内含子可能在基因翻译中起增强子的作用。加入翻译起始密码子由于植物中mRNA的翻译起始密码子多数也是AUG，因此，要在目的基因功能蛋白的编码序列前加上适当的核苷酸序列。加入终止密码子植物基因工程中所使用的mRNA翻译终止密码子有UAA、UAG、UGA三种。一般在目的基因功能蛋白的编码序列后直接加上对应的碱基序列。实验中通常采用的是Ti质粒中的Nos终止子。加入增强序列加入与植物中特定DNA同源的序列为了实现将目的基因和植物基因组有效整合，植物基因工程中常在目的基因两端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以结合植物基因组表达调控规律，通过调整所加同源序列的碱基序列有效地控制外源基因的插入位点和表达时间，使目的基因更便于操作以及整合后更好地发挥作用。加入报道基因常用的报道基因：lacZ、ocs、cat、nptⅡ、lux和gus2.3目的基因向植物的转化◆近年来，植物的遗传转化技术得到了迅速的发展，已建立了多种转化系统，如以农杆菌Ti质粒及Ri质粒为载体的转化系统，以PEG介导的原生质化学导入法、电激法、基因枪法、花管导入法等等。总之，植物细胞遗传转化系统可分为两大类：以载体为介导的基因转化（vectormediatedgenetransfer）和DNA直接转化（nakedDNAtransfer）。2.4转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定◆植物外植体经过农杆菌或DNA直接转化后，大部分细胞是没有转化的，只有极少数是转化的，这就需要采用特定的的方式将未转化细胞与转化细胞区分开来，淘汰未转化的细胞，然后利用植物细胞的全能性在适宜的环境条件下使转化的细胞再生成可育的转基因植株。◆目前，转化细胞与非转化细胞的区分及非转化细胞的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草剂基因，总称筛选标记。植物基因工程中常用的筛选标记是nptⅡ（neomycinphosphotransferase）基因和cat（chloramphenicolacetyltr-ansferase）基因第七章转基因作物及其外源抗性基因检测技术概况世界上已批准进行商品化转基因作物：大豆、玉米、棉花、西红柿、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜等，其中前四种超过了99％，种植面积最大的是转基因大豆，种植面积为3650万公顷，占62％，其次是转基因玉米，种植面积为1240万公顷，占21％，第三是转基因棉花，种植面积为680万公顷，占12％，第四是转基因油菜，种植面积300万公顷，占5％。