医学标书

医学科研项目申请书项目名称：白介素17在舌鳞状细胞癌中的作用研究申请人：付超学号：2014110931专业：口腔医学（颌面外科方向）电话：[phone]所在单位：重庆医科大学附属口腔医院授课老师：公共卫生与管理学院流行病学教研室唐晓君一、研究背景和依据（国内外研究现状、研究意义及研究工作必要性）1.舌鳞状细胞癌1.1舌鳞状细胞癌的特点及治疗舌癌在口腔癌中发病率高，近30年来舌癌一直占据口腔癌部位发生率的第一位，舌癌的病理类型以鳞状细胞癌最常见，舌鳞状细胞癌容易发生淋巴结转移，预后较差。目前主要以综合治疗为主，手术治疗常需器官切除，极大影响患者生存治疗和生活水平，术后辅以放化疗，但对于存在转移的病例，疗效仍然较差。影响舌鳞状细胞癌的预后因素包括患者年龄、有无烟酒嗜好、肿瘤原发部位、浸润范围、有无淋巴结转移、治疗因素如手术方式、是否综合治疗等。尽管现在早期舌癌的诊断率比以前大为提高,但仍有部分患者治疗效果差、预后不良,对影响舌鳞状细胞癌发生、发展及预后因素的研究仍很重要。1.2影响舌鳞状细胞癌预后的因素影响舌鳞状细胞癌预后的因素包括患者因素、肿瘤因素和治疗因素，人们传统观念可能认为年轻者预后较好，年长者预后差，但可能忽视了下列因素：①能够被治疗的患者因年龄的增长而死亡；②因年龄的增长而死于其他类疾病；③因年龄的增长，肿瘤分期表现可能发生改变；④依赖于年龄的基础生物效应可能影响肿瘤生长的速率。因此应将年龄与诸多方面因素综合起来判断预后。手术方式的影响，部分切除术生存率优于全切除术。而在手术中保证切缘阴性是提高喉癌患者术后生存率，降低复发率和转移率的重要方面。在肿瘤部位和TNM分期方面，无转移及累计范围较小的肿瘤预后较好；颈淋巴结转移是影响预后的重要因素，出现淋巴结转移患者5年生存率下降50%。术后处理方式的不同也会影响其预后，在晚期舌癌患者中，单纯放疗效果差，手术常需配合术后放疗来提高疗效，虽然晚期患者行综合治疗已成共识，但是大多认为不能提高远期生存率。2.白介素17生物学特点2.1IL-17的由来1993年Rouvier等首次从激活的啮齿类T细胞杂交瘤中克隆出T淋巴细胞抗原8（CTLA-8）的cDNA序列，并发现其与一种T细胞疱疹病毒——松鼠猴疱疹病毒(Herpesvirussaimiri)的第13个开放阅读(HSV13,vIL-17)有57%的同源性。Yao等1995年发现CTLA-8蛋白可以分泌到胞外，能激活成纤维细胞的NF-kB，诱导IL-6的分泌，可以共激活T细胞增殖，并基于其类似细胞因子的性质，提议将其命名改为白介素17(IL-17)。研究发现IL-17家族成员以同源二聚体或异源二聚体的形式行使功能。2.2IL-17的生物学作用IL-17是Th17分泌的特征性细胞因子，它是一种前炎性细胞因子,具有强大的招募中性粒细胞,促进多种细胞释放炎性因子等多种生物学作用。IL-17通过与IL-17受体结合诱导下游基因表达细胞因子或通过TH17参与细胞免疫发挥功能，如参与多发性硬化、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，并且能够在保护宿主防御感染中起作用。IL-17作为炎症因子在肿瘤发生中的作用备受关注。一方面IL-17可通过诱导IL-6活化Stat3（信号转导子和转录活化子3）通路，上调抗凋亡、促生长和促血管生成基因的表达，促肿瘤发生发展。另一方面IL-17也能通过诱导趋化因子招募杀伤性效应细胞及树突状细胞至肿瘤部位杀伤肿瘤细胞，从而间接起到抗肿瘤作用3.IL-17与肿瘤相关研究1863年RudolfVirchow观察肿瘤组织中存在白细胞，推测癌症可能起源于慢性炎症部位；随着研究的深入，也有理论认为慢性炎症将产生有利于肿瘤细胞生存和生长的亲肿瘤微环境，炎症与肿瘤的关系备受关注。白介素17（IL-17）作为辅助性T细胞TH分泌的特征性细胞因子，在宿主防御、自身免疫性疾病中发挥重要作用，有研究发现在胃癌、结肠癌、原发性肝癌、卵巢癌、骨髓瘤等癌组织或外周血中也检测到IL-17的高表达，提示IL-17可能广泛表达于肿瘤患者体内和肿瘤局部。有研究表明，在人非小细胞肺癌中IL-17通过促进趋化因子表达、内皮细胞移行以及血管再生，能够促进血管生成和肿瘤的生长；同时在体外实验中发现IL-17通过增强肿瘤细胞的抗凋亡能力直接促进肿瘤生长。但也有研究揭示:在乳腺癌患者外周血及组织中，检测IL-17阳性表达却明显低于健康对照组。通过以上介绍，IL-17在肿瘤方面有重要的研究意义。因此检测舌鳞状细胞癌组织中IL-17的是否高水平表达，并进一步探讨IL-17与舌鳞状细胞癌的发生、发展及预后的关系，并初步展望IL-17在舌癌治疗中的意义。二、参考文献（此处省略）三．研究目的在舌鳞状细胞癌组织标本及阴性切缘中检测IL-17表达水平，分析其与舌鳞状细胞癌临床病理特征的关联性以及IL-17的表达与舌鳞状细胞癌患者预后的关系，探讨IL-17在舌鳞状细胞癌免疫治疗方面的理论意义。四．研究内容1．检测IL-17在舌鳞状细胞癌组织的表达水平。收集至少50例以上舌鳞状细胞癌患者的病历资料，并要求该患者均接受手术切除并经病理确诊为舌鳞状细胞癌且随访资料完整。所有患者均为首次接受手术治疗，术前均未行放疗、化疗或分子靶向治疗等，并进行了常规的影像学检查(CT、MRI)，术后病理诊断均为鳞状细胞癌，声并选取切缘阴性的癌旁组织作为对照组。利用免疫组化方法检测IL-17在舌鳞状细胞癌组织中的表达水平。2.探讨IL-17在舌鳞状细胞癌的生物学意义。2.1IL-17与舌鳞状细胞癌临床病理特征的关联性利用统计学方法分析研究IL-17的表达与舌鳞状细胞癌的年龄、性别、原发灶部位、原发灶分期、肿瘤分化程度、区域淋巴结转、远处转移、复发是否有关。2.2IL-17的表达与舌鳞状细胞癌患者预后的关系利用Kaplan-Meier法统计3年生存率和5年生存率。并采用log-rank法进行单因素生存分析，IL-17阴性患者总生存率与IL-17阳性患者总生存率差异是否具体统计学意义；以及肿瘤原发灶部位区域淋巴结转移、远处转移、IL-17的表达对喉癌患者总生存率的影响五、研究方法及技术路线:1.试剂和方法所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚的切片，HE染色、免疫组化染色及光镜观察，采用免疫组化SP法进行IL-17染色。每个蜡块连续切片2张，置于二甲苯中脱蜡透明，梯度乙醇脱水至水化，3%H2O2室温处理15min，磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗3次，每次5min，高温煮沸抗原修复15minPBS浸洗5min，行IL-17免疫组化染色，PBS代替一抗作阴性对照。2.结果判断观察阳性结果采用双盲法，所有的免疫组织化学染色结果都经过2位病理医师独立判定。光镜下每张切片中选取3个典型区域在400倍光镜下计数肿瘤组织中阳性细胞数，取2位实验者结果的平均值，以细胞质和(或)胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。判断标准:阳性肿瘤细胞率为0-10%，转换数值为0；阳性肿瘤细胞率为11%-30%，转换数值为1；阳性肿瘤细胞率为31%～70%，转换数值为2；阳性肿瘤细胞率为71%及以上，转换数值为3。染色强度的评定：肿瘤细胞无染色为0，染色浅黄色为1，棕黄色为2。染色指数为染色阳性细胞率和染色强度的乘积。染色指数为1记为低表达，染色指数2-6记为高表达。染色指数为0记为-，染色指数≧1记为+。3.统计学方法应用SPSS16.0进行统计分析。IL-17表达与喉鳞状细胞癌患者临床病理资料之间的差异检验，两组比较采用两个独立的秩和检验。采用Kaplan-Meier法统计喉癌患者生存率，Log-rank法进行单因素生存分析，应用Cox比例风险回归模型分析筛选影响喉鳞状细胞癌患者生存情况的独立危险因素。六、创新性：研究表明在多种人类恶性肿瘤中IL-17表达升高，如胃癌、原发性肝癌、卵巢癌、骨髓瘤等；而国内外针对IL-17在舌鳞状细胞癌表达水平的研究较少，通过IL-17研究在肿方面的作用，我们猜想IL-17在舌鳞状细胞癌中同样存在高水平表达并发挥相应生物学作用。本实验中，①、利用免疫组化方法检测IL-17在喉鳞癌组织中的表达情况；②、通过统计学分析来评价IL-17和喉鳞状细胞癌的发生是否存在正相关性和IL-17的表达与肿瘤患者的原发灶分期、肿瘤分化程度、区域淋巴结转移、远处转移及复发是否有关；、通过Log-rank法进行单因素生存分析，性别、年龄及肿瘤是否与IL-17表达相关。七、可行性分析：可行性包括两方面内容：标本来源及研究条件标本来源重庆医科大学附属口腔医院每年有大约200例舌鳞状细胞患者前来就诊，为我们进行临床口腔癌组织的研究提供了充足的病理标本及资料来源。研究条件重庆医科大学附属口腔医院的生物实验室属重庆市市级重点实验室，拥有相对完善和先进的实验仪器设备，如：无菌细胞培养室、流式细胞仪、酶标仪﹑冰冻切片机﹑Bio-Rad凝胶/发光图像分析系统等，这些仪器设备基本上可满足本实验的需要。