浙江大学细胞培养-基本技术

细胞培养基本技术培养技术细胞系的建立和鉴定培养物的固定、染色显微镜观察1、细胞培养技术细胞原代培养细胞传代培养细胞冻存和复苏细胞的运输1.1细胞的原代培养•是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。•幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养意义•原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。•利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学方面）效果很好。•原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。•掌握无菌操作技术•了解小鼠解剖操作技术•了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散•了解倒置显微镜的使用原代细胞培养的实验目的和要求实验材料•实验动物：孕鼠或新生小鼠•液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯原代细胞培养方法•胰酶消化法•组织块直接培养法冷消化温消化一次性消化分次消化消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。贴块法消化法原代培养方法分类分次消化消化法的分类外植块培养步骤图解操作步骤1---取材•用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。•把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。•用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。•用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。•剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。•漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。操作步骤2---切割•将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。•然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。•静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。胰酶消化法操作步骤---消化、接种培养•视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。•加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。•静置5-10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。•1000rpm，离心5-10min，弃上清液。•加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。•加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。•将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。胰酶消化法操作步骤---消化、接种培养也可将此步骤简化为：•视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40min，每隔5min振荡一次。•静置，吸去上清，用细胞生长液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。•取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×105/ml左右），37℃下培养。（注意：省略了离心、计数等步骤）组织块直接培养法操作步骤•组织块接种：–将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。–翻转瓶底朝上，将细胞生长液加至瓶中，培养液勿接触组织块。–37℃静置3-5h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入细胞生长液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。原代细胞培养结果•细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长•如接种的细胞密度适宜，5-7d即可形成单层1.2传代细胞培养•细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3-6次•培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或1:3以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养。•也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。•悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1.悬浮生长细胞传代•离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。•直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.半悬浮生长细胞传代（HeLa细胞）•此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代•采用酶消化法传代。常用消化液是0.25％胰蛋白酶液。消化法传代培养步骤选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2-3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）加入适量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。贴壁生长细胞传代方法传代细胞培养结果•一般情况，传代后的细胞在2h时左右就能附着在培养瓶壁上，2-4d就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000rpm/min）5min。(区别贴壁传代)在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。观察：细胞培养24h后，即可进行观察。悬液细胞的传代培养要预先与临床外科医生和护士商量，并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清取手术标本的部位及注意事项。1.3人体活检(或手术)材料标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知工作人员。取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。人体活检(或手术)材料•整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。•在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。•整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的(4℃)含平衡盐溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超过24-48h(视不同组织类型而定)。需要注意的事项1.4培养细胞生长测定•是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。•任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。•方法：细胞计数法台盼蓝染色法生长曲线法四唑盐（MTT）比色法细胞计数用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。血细胞计数板人工计数细胞计数器血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)血细胞计数板。细胞计数实验原理：•血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0×10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。•存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。细胞计数•具体操作：1.将计数板及盖片用75%酒精擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2.吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104×稀释倍数注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液•由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。•台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约2min）。台盼蓝排除检测法①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。活体染色与细胞计数细胞生长曲线的绘制•细胞生长曲线(cellgrowthcurve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。•它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。•1)培养细胞首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0h。•2)计数细胞密度从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次。如此操作至第七天结束。3)绘制曲线以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。•四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝•四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。•二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，用酶标仪测定OD570nm值。•MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。四唑盐（MTT）比色法•操作步骤四唑盐（MTT）比色法①100L单细胞悬液接种于96孔板(5×104)。37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间②加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；继续培养3h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150L/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果。•高浓度血清可影响光吸收值，在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。•吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。1.5细胞冻存和复苏•Spallanzani(1776)最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。•1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮存的事实。•Polge等人(1949)发现了甘油对低温下贮存细胞的保护作用。•Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现电解质浓度增大是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。•Lovelock等人(1959)发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的二甲基亚砜(DMSO)。•当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技