诊断酶学

酶促反应动力学酶促反应的影响因素及反应条件的选择(一)酶浓度病理情况下，酶浓度过高时，底物过早且过多被消耗，影响酶活性测定。(二)底物的种类和浓度研究酶的生理作用时，一般选择Km最小的最适底物。临床酶学测定时，先考虑有较高诊断价值的底物。一般酶测定时底物浓度最好为Km的10－20倍。(三)缓冲液的种类、离子强度和pH不同种类的缓冲液配制相同pH介质所测酶活性并不相同。缓冲液的离子强度也影响酶的活性。各种体液样品本身也是缓冲液，也会影响酶活性测定结果，一般样品在总体积中的比例应不超过10％。缓冲液中的物质不应与分析系统中的任何物质反应。(四)温度酶的最适温度与底物浓度、pH、离子强度、保温时间等许多因素有关；测定酶活性推荐3种温度；如250C，30℃和37℃。我国推荐温度为37℃。酶制剂应保存在冰箱中，取出后应恢复至室温立即应用，以免发生变性。(五)激活剂与抑制剂临床酶学测定中广泛应用金属离子等激活剂来提高测定的灵敏度。在设计和选择酶测定方法时，应避免抑制剂对酶促反应的影响。如脲酶测定，先通过透析、凝胶色谱或超滤等方法将尿中一些小分子抑制剂与酶分开。血清酶一、血清酶的来源1、血浆特异酶：作为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶。如与凝血、纤溶有关的酶等。以酶原形式分泌入血。多数在肝脏合成，肝功能减退时，血浆中这些酶活性降低。另外：ChE、铜氧化酶(铜蓝蛋白)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)和脂蛋白酯酶等。2、非血浆特异酶：①外分泌酶：来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如胰淀粉酶、胰蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。②细胞酶：存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随着细胞的新陈代谢，有少量酶释入血液。只有小部分来源于特定组织，有器官专一性。二、血清酶的去路1．血清酶的半寿期：酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶的半寿期(T1／2)。代表酶从血中清除的快慢。2．血清酶的失活和排泄：酶主要是在血管内失活或分解的。三、血清酶变化的病理机制(一)酶合成异常1．合成减少：肝损害时，如：血清中ChE常和清蛋白的浓度相平行;肝病时因LCAT合成的减少而使血清中该酶浓度降低，并且比血清清蛋白的减少更为灵敏。酶基因变异，如肝豆状核变性患者，血中铜氧化酶可明显下降。2．合成增多：增生性疾病，如骨骼疾病时，因成骨细胞增生，合成分泌更多的ALP。恶性肿瘤，肿瘤细胞中酶的合成增加，如前列腺癌细胞产生大量ACP。酶的诱导作用，如巴比妥类、乙醇药物可诱导肝γ-GT的合成，血清中的酶活性随之增高。(二)酶释放增加细胞酶的释放的影响因素：1．细胞内外酶浓度的差异：如肝细胞内LD大于细胞外液的3000倍以上，红细胞中此酶亦大于血浆的200倍。非血浆特异酶，只要有少量细胞受损伤，酶从细胞中释出，血液中酶明显升高。2．酶的相对分子量：各种酶从胞内释出的速度与酶的相对分子量成反比。3．酶的组织分布：如临床常用的AST、ALT和CK三种酶分别以心、肝和骨骼肌含量最丰富。含酶量高且血流丰富的组织器官，病变时可引起血清酶活性变化。4．酶在细胞内的定位和存在形式：线粒体中的酶不易从细胞中释出，如GLD、ASTm及苹果酸脱氢酶(MDm)。和结构蛋白结合，或以多酶复合物的形式存在，较难释出细胞。(三)酶排出异常肾功能减退时，血清AMY活性升高;胆道梗阻时，血清ALP升高;很多疾病时血清酶增高的机制是多方面的，是多种因素综合作用的结果。四、血清酶的生理差异许多因素可引起人血清中某些酶浓度的生理性变化。如性别、年龄、饮食、锻炼或日周期节律、人种、地理及其他环境因素等。应注意生理差异对测定结果的影响。1、性别：无差异，少数酶如CK、GGT，男女。2、年龄：血清中有些酶的活性常随年龄而变化。例：CK、LD；年龄引起酶变化最明显的酶是ALP。3、进食：不受饮食影响，故不必空腹采血。高脂、高糖饮食后血清ALP活性升高。酗酒可引起GGT明显升高。4、运动：肌肉中含量丰富的CK、LD、AST与运动量及持续时间有关，抽血前不宜过度运动。5、妊娠与分娩：妊娠期某些酶升高，如铜氧化酶升高，分娩时，CK、CK-BB、AST、LD等升高。6、其他：种族差异、与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素等有关。酶活性浓度的测定技术一、概述正常人血中大部分酶一般在pg到ng水平。常用的酶学测定方法：“酶活性浓度”。按监测方法分类分为：量气法、分光光度法、荧光法和放射性核素法、电极法和其他方法。以分光光度法最为常用。分光光度法：50年代起采用最大优点：扩大了测定范围，波长范围更宽。结合工具酶的偶联反应，应用NAD(P)H和NAD(P)＋吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，可应用于各种血清酶活性的测定。自动生物化学仪和配套用试剂盒。荧光法和放射性核素法：荧光法或放射性核素法灵敏度较高，适用酶浓度很低的标本。通过荧光光度计测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例：还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，所有以NAD(P)＋为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。二、酶活性浓度的测定按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为：定时法、连续监测法。1．定时法：早期测定酶活性浓度的方法测定一段这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。优点：比较简单，因测定时酶促反应已终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也不考虑对酶活性的影响。缺点：无法知道整个酶促反应中是否都是零级反应。2．连续监测法：连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度。优点：方法简单，可将多点的测定结果连接成线，容易找到成直线的区段，观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。三、连续监测法测定酶活性浓度(一)连续监测法的种类1．直接法：在不终止酶促反应下，直接测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH等，计算酶活性浓度。分光光度法应用最广泛，最成熟的一种2．间接法：1）在原来反应体系中加入一些试剂，只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检出的物质变化，但同时不和酶作用，也不影响酶活性。例：是血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法。2）酶偶联法：应用最多，最广泛的，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。(二)酶偶联反应最简单(单底物反应只有一个工具酶)模式为：被测定酶(Ex)催化的反应称始发反应；产生被检测物质产物C(如NADH)的反应称为指示反应，相应的偶联酶(第二个酶)酶称指示酶(Ei)。(三)干扰因素1．其他酶和物质的干扰：2．酶的污染：因试剂用酶多从动物组织或细菌中提取，易污染其他酶，如不除去将引起测定误差。3．非酶反应：4．分析容器的污染：5．沉淀形成：四、工具酶在酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。常使用酶偶联体系测定，指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。(一)常用工具酶及其质量要求常用工具酶多为氧化还原酶类工具酶纯度不必求过高，才能降低作为试剂的成本。但减少或避免干扰测定的副反应。(二)工具酶参与的指示反应最常用两类分光光度法：1）利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢(H202)，再加氧化发色剂比色；2）利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)－NAD(P)H的正／逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。六、酶活性浓度的单位(一)酶活性单位惯用单位，国际单位，Katal单位(二)酶活性浓度单位酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。1．表示方法：U／L2．酶活性浓度单位的计算：利用标准管法、标准曲线法或摩尔消光系数法进行计算求取酶活性浓度单位。酶的免疫化学测定(一)测定原理RIA分：直接法：将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。间接法：将样品中无放射性的酶蛋白与放射性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争，根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。两种表示结果：1）用酶活性浓度单位：U／L；2）用质量浓度单位，：直接用ng／ml或pg／L报告。临床医生应注意报告方式不同所带来的差异。(二)免疫化学测定的优缺点优点：①灵敏度高，少量或痕量酶；②特异性高，不受体液中其他物质，如酶抑制剂、等的影响；③能测定不表现酶活性的酶蛋白，如酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异合成无活性的酶蛋白的测定；④特别适用于同工酶的测定局限性：①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清；②测定步骤多，操作繁琐；③测定成本高。同工酶及其亚型测定一、概念同工酶：催化功能相同而结构不同的一类酶。同工酶是同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体。“亚型”，也称为同工型:某些酶或同工酶从组织进入体液后，进一步变化为数个不同类型。由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。二、分析方法临床同工酶的分析:1）分离出某酶的各同工酶组分；2）测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性。电泳法注意事项：用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要注意巨分子酶的存在。原因主要有：①酶与免疫球蛋白形成的复合物；②酶与其他蛋白质形成的复合物；③酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。如临床症状不明显，血清酶活性不正常但临床表现不典型，同工酶图谱异常时要警惕血清中有无巨分子酶。色谱法常用柱色谱，方法费时繁琐，不适合临床同工酶常规检测。免疫分析法同工酶的免疫化学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制备特异性的抗血清。抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。临床常用血清酶、同工酶及其亚型分析临床上根据酶浓度的变化用以辅助诊断。若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在。酶谱：指同时测定的一组性质不同的酶，通过比较各酶活性的变化，根据酶增高或减少的“谱型”做出诊断。(1)心肌酶谱：简单而有效的心肌酶谱由CK、CK-MB、CK-MB亚型或CK-MM亚型组成。(2)肌酶谱：用于对骨骼肌疾病的诊断和监护。可供选择的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶。若能再加CK-MM亚型则更为理想。(3)肝酶谱：用来判断有无肝实质细胞损伤、肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。（4）肿瘤酶谱：具有器官特异性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。（5）胰酶谱：主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断。有AMY及其同工酶等。一、转氨酶(ALT，AST)及其同工酶AST同工酶：细胞质(ASTs)、线粒体(ASTm)；ALT同工酶：细胞质(ALTs)、线粒体(ALTm)；组织分布：AST含量：心肝骨骼肌肾。ALT含量：肝肾心骨骼肌等。肝ALT多存在于胞质，肝中AST多存在于线粒体。生理变异：变异不大。标本的采集、处理和贮存：忌溶血，宜用血清，贮40C冰箱一周，活性无变化，忌冰冻。1、丙氨酸氨基转移酶(ALT）肝炎时血清ALT升高，与病情轻重相平行,是肝损伤的一个很灵敏指标；ALT半寿期长，是判断急肝恢复的一个好指标。慢肝特别是慢性活动性肝炎ALT常升高。重症肝炎（大量肝细胞坏死）血中ALT仅轻度增高，临终时明显下降，但胆红素进行性升高，即“胆酶分离”。另外：胆石症、胆囊炎、肝癌、有些药物如异菸肼、利福平等ALT升高。2、天冬氨酸氨基转移酶(AST)—GOT在AMI时升高迟于CK，恢复早于LD，诊断价值不大。在肝中AST低于心肌，主要存在于线粒体中病变轻的肝病如急性肝炎ALTAST慢性肝炎，肝硬化时，病变累及线粒体，ASTALTAST／ALT比值正常约为1．15，急性肝炎时1，慢性肝炎，比值升高，肝硬化，